Ricostruzione delle traiettorie di interazione

L'algoritmo di ricostruzione di traiettorie di particelle colocalizzate consta dei seguenti punti, meglio descritti nel seguito:

1. Suddivisione dei lmati e creazioni di maschere 2. Ricostruzione di traiettorie nelle singole nestre 3. Colocalizzazione di particelle di diverso colore 4. Traiettorie di particelle colocalizzate

Suddivisione dei lmati e creazione di maschere

Figura 5.2: Esempio di creazione di una maschera. Nella prima immagine è riportato il primo frame del lmato (canale rosso); nel secondo la proiezione di massima intensità su cui individuare i contorni della cellula, nella terza immagine il primo frame dello stesso lmato con la maschera applicata ed una scala di intensità diversa.

Il lmato di ogni cellula, che comprende entrambe le nestre, viene diviso nelle parti corrispondenti ai due canali allo stesso modo in cui è stato divisa l'immagine da usare per la calibrazione (Ÿ5.2.1).

Prima di localizzare gli spot e ricostruire le traiettorie vengono esclusi uorofori adesi in maniera aspecica al fondo della willco che potrebbero indurre ad errori nel tracking, cercando di limitare l'analisi SPT solo alla parte del lmato dove sia eettivamente presente una parte di membrana basale di una cellula. A questo scopo viene creata una proiezione di massima intensità del lmato di uno dei due colori per visualizzare le zone attraversate dai uorofori in movimento, che appaiono come ampie zone ad alta intensità; i uorofori adesi in maniera aspecica sono visibili invece come spot isolati. Su questa immagine l'utente seleziona l'area di interesse (quella in cui i uorofori si muovono) e nella parte rimanente dell'immagine l'intensità viene posta uguale a 0 (Fig. 5.2). La stessa maschera è applicata poi anche al lmato dell'altro canale. Può essere utilizzata la stessa maschera senza applicare la trasformazione di coordinate in quanto lo spostamento tra le coordinate è piccolo rispetto alla distanza tra il bordo della zona attraversata dai uorofori e il contorno della zona che viene selezionata.

Queste operazioni sono state implementate tramite la funzione MatLab riportata in A.4.

Localizzazione e ricostruzione di traiettorie nei singoli canali

Gli algoritmi di u-track per la localizzazione e il tracking vengono utilizzati sui lmati corrispondenti ai due canali su cui è stata applicata la maschera, con la possibilità di impostare parametri diversi per i due colori.

Colocalizzazioni di particelle di diverso colore

In questa parte vengono individuati gli spot dei due colori che si trovano colocalizzati. Mediante la funzione di trasformazione determinata con la calibrazione delle due nestre, le coordinate degli spot verdi vengono portate nel sistema di riferimento del canale rosso.

Si cercano quindi le colocalizzazioni denendo due spot colocalizzati se si trovavano entro una distanza pari a 2.54 volte (C.L. 99%) l'incertezza totale di localizzazione che è data dalla somma in quadratura dell'incertezza di localizzazione vera e propria (determinata da u-track nella fase di individuazione degli spot) e dell'incertezza di sovrapposizione dei due canali (determinata dalla trasformazione delle coordinate verdi). La distanza entro cui due spot sono considerati colocalizzati risulta quindi diversa per ogni coppia di punti, in modo da tenere conto del fatto che i vari spot hanno diverse incertezze di localizzazione.

Per implementare questa ricerca si può utilizzare la funzione rangesearch di MatLab che permette di trovare tutti i punti che sono entro una certa distanza da uno specico punto. Questa funzione può utilizzare due diversi algoritmi di ricerca: un algoritmo esaustivo (Exhaustive Search) e un algoritmo di tipo albero kd (kd Tree).

Un algoritmo kd Tree divide i dati in gruppi, in questo caso a seconda delle coordi- nate; in tale modo, nella ricerca degli spot verdi colocalizzati con un certo spot rosso verrebbero presi in esame solo gli spot verdi più vicini, cioè che si trovano nello stesso gruppo del rosso ed eventualmente in un gruppo vicino.

In generale in un algoritmo di tipo esaustivo, invece, vengono esaminate tutte le possibilità e in questo caso quindi per ogni spot rosso verrebbero presi in esame tutti gli spot verdi.

Un algoritmo kd Tree può consentire una ricerca più veloce nel caso in cui i punti siano molti e la dimensione dello spazio dei parametri in cui vengono localizzati i punti sia relativamente bassa (meno di 10 dimensioni, solo le coordinate con le loro

incertezze nel nostro caso). Tuttavia il metodo esaustivo è più essibile rispetto alla scelta della metrica di distanza.

Si è scelto quindi di utilizzare un algoritmo esaustivo (vericando che la ricerca avvenisse in tempi ragionevoli che sono risultati dell'ordine di 1 - 10 s) denendo una distanza nel seguente modo:

d = (xG− xR) 2_{+ (y} G− yR)2 2.542_(σ2 Gx+ σ 2 Gy + σ 2 Rx+ σ 2 Ry)

(dove le σG sono date dalla somma in quadratura dell'incertezza di localizzazione

degli spot verdi e dell'incertezza di sovrapposizione data dalla funzione di trasforma- zione delle coordinate mentre le σRx hanno solo il primo contributo) e cercando, per

ogni spot rosso, gli spot verdi che si trovano entro una distanza pari a 1.

Gli spot colocalizzati vengono memorizzati in una variabile che ha le caratteristi- che di quelle utilizzate come input nelle funzioni per il tracking. È necessario denire per lo spot colocalizzato coordinate, incertezza sulle coordinate, ampiezza, incertezza sull'ampiezza. Le coordinate vengono denite mediante la media pesata, conside- rando l'incertezza, delle coordinate dello spot rosso e dello spot verde da cui deriva, le incertezze sulle coordinate sono denite come qσ2

Gi+ σ

2

Ri (i = x, y), l'intensità

come la somma di quelle dei due spot, l'incertezza sull'intensità come la somma in quadratura delle incertezze sulle ampiezze dei due spot.

La funzione sviluppata in MatLab per svolgere la ricerca delle particelle colocaliz- zate è riportata in A.5.

Traiettorie di particelle colocalizzate

Gli algoritmi di u-track per la ricostruzione delle traiettorie vengono utilizzati sui soli spot considerati colocalizzati per ricostruire le traiettorie di interazione. Si è voluto ricostruire le traiettorie degli spot colocalizzati in quanto due particelle possono trovarsi colocalizzate in un frame per una coincidenza casuale, ma se rimangono colocalizzate per più frame consecutivi, questo è un forte indicatore del fatto che stanno interagendo.

Capitolo 6

Risultati e discussione

In questo capitolo presento risultati ed analisi degli esperimenti di microscopia e spettroscopia non direttamente implicati nella fase di ottimizzazione dell'apparato sperimentale.

Nelle fasi iniziali del mio lavoro sperimentale ho eettuato esperimenti prelimina- ri che hanno evidenziato varie dicoltà arontate successivamente: basso rapporto segnale-rumore, alto livello di segnale aspecico nel canale rosso causato da eccitazione a 488 nm, problemi connessi con l'instabilità dei uorofori, in particolare photoblea- ching (Ÿ6.1). I lmati acquisiti nel corso di questi esperimenti avevano una qualità troppo bassa per poter ricostruire traiettorie di singole molecole. C'è stata quindi necessità di aumentare il rapporto segnale/rumore, scegliendo opportunamente i ltri per il dual view e acquistando il nuovo cubo di uorescenza (Ÿ4.1.2), e di limitare il photobleaching ed il blinking; per quest'ultimo motivo si sono svolte le misure descritte nelle sezioni 6.2 e 6.3. Per avere la possibilità di testare la ricostruzione di traiettorie di più colori, anche colocalizzate, sono state svolte misure in un caso in cui la dime- rizzazione del recettore era nota (TrkA in presenza di NGF, Ÿ6.4). Nel frattempo, al NEST era stato sviluppato un putativo controllo positivo di omodimerizzazione, per cui ho svolto una prima misura su questo costrutto anche a due colori, come descritto nella sezione conclusiva di questo capitolo.

Figura 6.1: Quest'immagine mostra il segnale aspecico rivelato nel canale rosso all'accensione del laser a 488 nm. Nella prima immagine il laser a 488 nm è spen- to, nella seconda è stato acceso, con una potenza di ∼3 mW dopo l'obiettivo. Le immagini sono mostrate con la stessa scala di livelli di verdi.

6.1 Esperimenti preliminari

Si sono svolti alcuni esperimenti preliminari su cellule della linea SKNBE trasfettate con il recettore TrkA con il tag ACP. I recettori sono stati marcati con 5nM di uoroforo rosso e 5nM di uoroforo verde.

Questi esperimenti sono stati condotti quando l'apparato sperimentale non era ancora completamente ottimizzato sia per quanto riguarda il cubo di uorescenza sia per quanto riguarda i ltri nel dual view. La principale dicoltà evidenziata è stato l'alto livello di segnale di fondonel canale del rosso eccitato dal laser a 488 nm: alla sua accensione, il livello di tale background aumentava di circa il 150% (Figura 6.1). Questo problema è stato migliorato sostituendo nel dual view il ltro per il canale rosso ET605LP con il ltro r647lp (come accennato nella sezione 4.1.2).

Dopo tale miglioramento altri esperimenti preliminari sono stati condotti su cellule SKNBE e su cellule SHSY-5Y trasdotte con il costrutto S6-TrkA o con il costrutto S6- p75 sotto promotore inducibile. L'espressione è stata indotta con una concentrazione di 1 μg/ml di doxiciclina per realizzare una condizione di bulk o con concentrazioni dell'ordine di 1-100 ng/ml per poter osservare le singole molecole. Nella reazione di marcatura sono state utilizzate concentrazioni di uorofori dell'ordine di 10-100 nM nel primo caso e di 1-10 nM nel secondo.

È stato osservato un miglioramento nell'aumento del background nel canale rosso provocato dall'accensione del laser a 488 nm. Tale aumento è risultato infatti intorno al 40%. Non è stato possibile comunque eettuare un'analisi di SPT sui lmati acquisiti a causa di ulteriori dicoltà riscontrate.

In questi esperimenti non sono stati utilizzati reagenti antibleaching ed infatti si è osservato un veloce decadimento del segnale proveniente dal uoroforo verde (Figura 6.2). Inoltre, dovendo limitare la potenza del laser a 488 nm per non produrre troppo background nel canale rosso e per limitare il photobleaching, le singole molecole nel canale verde non potevano essere distinte (6.3).

Per arontare le dicoltà connesse con il photobleaching sono state condotte le misure illustrate nella prossima sezione.

Figura 6.2: Immagini di un lmato estratte ai tempi dall'inizio dell'acquisizione indicati approssimativamente in basso a destra. Il campione comprendeva S6-p75 con livello di espressione alto e marcato con 10 nM di uorofori verdi e di uorofori rossi (condizioni di bulk). Si può osservare il decadimento del segnale verde (canale a sinistra), quanticato nel graco come intensità media di una zona dell'immagine comprendente la cellula misurata nei due canali, dopo sottrazione del segnale di fondo misurato in una zona del campo di vista al di fuori della cellula.

Figura 6.3: Esempi di immagini acquisite nel corso degli esperimenti preliminari su un campione di cellule esprimenti S6-p75 (sopra) e TrkA (sotto) marcati in condizio- ne di osservazione di singole molecole. È stato migliorato il livello di background prodotto nel canale rosso all'accensione del laser a 488, tuttavia il SNR nel canale verde era troppo basso per condurre un'analisi di SPT.

Inoltre, per migliorare il rapporto segnale-rumore in entrambi i canali si è deciso di acquistare un nuovo cubo di uorescenza come riportato nella sezione 4.1.2.