Ottimizzazione dei parametri di u-track

Come descritto nella sezione 5.1, nell'utilizzare il software u-track l'utente deve impostare i valori dei parametri necessari per l'analisi, alcuni dei quali sono cruciali per un risultato di SPT accurato. Nell'ottimizzazione di tali valori si è dovuto tenere conto anche del tipo di analisi a due colori che si vuole eettuare.

parametro canale verde canale rosso dev. std. 0.7 0.8 nestra temporale 1 1 alfa locale 14% 14% alfa ampiezza 9% 9% alfa distanza 5% 5% alfa residui 15% 15%

Tabella 6.3: Valori dei parametri utilizzati nei due canali nella fase di rilevamento e localizzazione del software u-track. (Per la denizione di questi parametri vedi Ÿ5.1).

La tabella 6.3 riporta i valori di tali parametri che sono stati utilizzati nella fase di detection. La deviazione standard della gaussiana che approssima il prolo del disco di Airy (dev. std.) risulta maggiore per il canale rosso a causa della dipendenza dei fenomeni di dirazione (e conseguentemente della risoluzione) dalla lunghezza d'onda della luce [(1.1), (1.2)].

La nestra temporale non è stata utilizzata in quanto è stato osservato che poteva causare l'allargamento degli spot caratterizzati da un movimento più veloce. Come accennato in precedenza, la media può essere eettuata quando le particelle non si muovono più di un kernel gaussiano nei fotogrammi che vengono mediati. Si può vericare dagli istogrammi che riportano la distanza tra gli spot collegati tra coppie di frame (vedi Figura 6.10), che una quantità considerevole di collegamenti sono indi- cativi di un movimento maggiore di un kernel gaussiano anche tra due soli frame sia in presenza che in assenza di ligando NGF. In un'analisi a due colori l'allargamento degli spot e la conseguente individuazione e localizzazione di due spot in corrispon- denza di un'unica particella può risultare maggiormente dannosa in quanto peggiora l'accuratezza di localizzazione e quindi può provocare la perdita della rivelazione di una colocalizzazione.

Il parametro "alfa locale" è stato impostato ad un valore relativamente alto (14%) a causa del basso rapporto segnale-rumore presente nella immagini, che non può essere migliorato con il processo di media temporale. Anche il valore di alfa residui è stato impostato a un valore abbastanza elevato soprattutto a causa della presenza di aggregati (cluster) di recettori in presenza di NGF; questi cluster producono delle macchie allargate ad intensità elevata nelle quali è stato osservato che il software non individua con facilità le diverse particelle. La localizzazione di un unico spot in corrispondenza di più particelle sovrapposte può risultare non accurata e causare la perdita di rilevazione di colocalizzazioni nell'analisi a due colori.

Per quanto riguarda i parametri di tracking, questi sono stati ottimizzati per ri- costruire le traiettorie nei due canali e per ricostruire le traiettorie degli spot coloca- lizzati. La tabella 6.4 riporta i valori di tali parametri. Nei singoli canali sono stati utilizzati gli stessi parametri poiché in entrambi veniva seguito lo stesso oggetto, e instabilità di uorescenza e SNR per i due uorofori erano abbastanza simili da non dover cambiare i parametri per la chiusura dei gap.

Figura 6.10: Istogrammi che mostrano la lunghezza (in pixel) dei collegamenti ef- fettuati tra coppie di frame consecutivi. In alto è rappresentato il caso di un'analisi condotta in assenza di NGF, in basso il caso di un'analisi condotta in presenza di NGF. La dierenza tra i due istogrammi è dovuta al rallentamento del recettore TrkA in presenza di NGF, già osservata in studi precedenti [30]. Si osserva come, in entrambi i casi, una quantità considerevole di particelle si siano spostate di una distanza maggiore di un kernel gaussiano (con deviazione standard di 0.9 pixel) per cui non può essere sfruttata la possibilità di mediare più fotogrammi per migliorare il rapporto segnale-rumore.

parametro singoli

canali colocalizzatispot

massima durata gap 8 10

lunghezza minima dei segmenti di traccia 3 1 massimo raggio di ricerca (pixel) 3.5 3.5

minimo raggio di ricerca (pixel) 0 0 fattore moltiplicativo per espansione del raggio 3 3 frame per calcolare la distanza dello spot più vicino 9 11

espansione veloce del raggio per i gap 0.5 0.5 espansione lenta del raggio per i gap 0.01 0.01 transizione da fase veloce a fase lenta 2 2 minimo rapporto di intensità per merge e split 0.5

massimo rapporto di intensità per merge e split 2

Tabella 6.4: Valori dei parametri impostati per la fase di tracking sugli spot dei singoli canali e sugli spot colocalizzati. I primi tre sono i parametri più critici che sono stati ottimizzati come spiegato nel testo. Per una spiegazione degli altri parametri si veda [24]; i loro valori sono stati impostati secondo quanto indicato dagli autori. Dove possibile, sono stati utilizzati gli stessi parametri sia per la prima fase di collegamento degli spot sia per la seconda fase di chiusura dei gap. La possibilità di rivelare eventi di merge e split non è stata utilizzata nel tracking degli spot colocalizzati.

La durata massima della nestra temporale per la chiusura dei gap è maggiore per il tracking degli spot colocalizzati rispetto al tracking nei singoli canali, dato che è più probabile avere mancate rivelazioni di spot colocalizzati rispetto a mancate rivelazioni nei singoli canali; infatti alle prime contribuiscono mancate rilevazioni di spot in entrambi i canali (quindi più probabili), ed inoltre c'è anche la possibilità di non rilevare una colocalizzazione per un errore troppo grosso nella localizzazione (di uno o entrambi gli spot) su cui l'incertezza è stata stimata male (esempi di questi eetti sono visibili nelle gure 6.11 - 6.16).

La lunghezza minima per considerare una traccia nella chiusura dei gap è stata impostata al valore 3 nei singoli canali, per escludere falsi positivi, ed al valore 1 per le traiettorie di colocalizzazione. È stato osservato infatti che aumentando tale parametro non si riuscivano a ricostruire molte traiettorie di colocalizzazione a causa dei fenomeni già accennati di mancate rivelazioni di uno dei due spot, di mancate co- localizzazioni, di dicile localizzazione sui cluster. In generale, eettuando il tracking con un valore elevato per la durata massima della nestra temporale per la chiusura dei gap ed un valore pari a 1 per la lunghezza minima delle traiettorie da considerare per la chiusura dei gap, si rischia di collegare tra loro traiettorie diverse e di includere falsi positivi soprattutto in condizioni di alta densità. Gli spot colocalizzati indivi- duati avevano una densità bassa, per cui non era molto probabile incorrere in questo tipo di errori pur con i valori dei parametri utilizzati. È stato osservato che in alcuni casi venivano ricostruite delle traiettorie molto brevi (della durata di alcuni frame), in cui lo spot era rivelato anche solo nel primo e nell'ultimo frame e tra i due frame veniva chiuso il gap per formare la traiettoria; queste tracce potevano quindi essere il frutto dell'unione di un paio di colocalizzazioni causali e sono state escluse dall'analisi come spiegato nella successiva sezione 6.4.3.

Nelle gure dalla 6.11 alla 6.16 è mostrato un esempio di ricostruzione di una traiettoria di colocalizzazione. È riportata un'immagine ogni 295 ms (ossia ogni 5 frame). Le immagini presentate sono ottenute dalla sovrapposizione dell'immaginedel canale verde dopo trasformazione per la sovrapposizione con quella del canale rosso (scala di verdi) e dell'immaginedel canale rosso (scala di rossi).

Le circonferenze rosse e verdi sulle immagini indicano la posizione di spot rilevati rispettivamente nel canale rosso e nel canale verde. La posizione delle circonferenze verdi mostrate è determinata applicando la funzione di trasformazione di coordinate dal canale verde al canale rosso.

Le circonferenze blu indicano che è stata rivelata una colocalizzazione; la linea gialla è la traiettoria di colocalizzazione ricostruita.

Figura 6.11: Nell'immagine a sinistra è riportato il frame di inizio della traiettoria di colocalizzazione. Sono stati rilevati i due spot verde e rosso (circonferenze verde e rossa) e sono stati considerati colocalizzati (circonferenza blu). Il triangolo giallo indica l'inizio della traiettoria. Nell'immagine a destra si può osservare che è stato rilevato solo lo spot rosso, l'asterisco giallo indica che nella traiettoria di colocalizza- zione viene chiuso un gap. La dimensione dei pixel è 160 nm (anche nelle immagini successive).

Figura 6.12: Nell'immagine a sinistra si può osservare che non è stato trovato né uno spot rosso né uno verde (la colocalizzazione che si intravede in alto corrisponde ad un'altra traiettoria); nella traiettoria di colocalizzazione viene chiuso un gap. Nell'immagine a destra entrambi gli spot sono stati localizzati e sono stati considerati colocalizzati; lo spot colocalizzato è stato collegato al precedente segmento di traccia.

Figura 6.13: In queste due immagini gli spot rosso e verde sono stati trovati e considerati colocalizzati; gli spot colocalizzati sono stati collegati al resto della traiettoria.

Figura 6.14: Nell'immagine a sinistra gli spot dei due colori sono stati rilevati e considerati colocalizzati; lo spot colocalizzato è stato incluso nella traccia. Nell'im- magine a destra è rilevato solo lo spot rosso e nella traiettoria di colocalizzazione viene chiuso un gap.

Figura 6.15: Nell'immagine a sinistra gli spot dei due colori sono stati trovati e considerati colocalizzati; lo spot di colocalizzazione è incluso nella traiettoria. A sinistra si può osservare come gli spot dei due colori siano stati rilevati ma non siano stati considerati colocalizzati; nella traiettoria di colocalizzazione viene chiuso un gap.

Figura 6.16: In queste due immagini gli spot rosso e verde sono stati trova- ti e considerati colocalizzati; gli spot di colocalizzazione sono stati inclusi nella traiettoria.

Figura 6.17: Esempio di un fotogramma di un lmato acquisito nel corso degli espe- rimenti sul recettore TrkA su cui sono mostrate le tracce di colocalizzazione (curve colorate) e la posizione degli spot rossi (circonferenze rosse), verdi (circonferenze verdi), e colocalizzati (circonferenze blu). Sono state sovrapposte le immagini dei due canali, sovrapponendo quella del canale verde (in scala di verdi) con quella del canale rosso (in scala di rossi) mediante la funzione di trasformazione tra le due nestre.