in tempi brevi, la citofl uorimetria, tecnica ana- litica strumentale che si basa sull’interazione tra particelle sospese in un mezzo liquido e la luce, prodotta da laser. Potremmo parago- nare questa tecnica ad un “microscopio au- tomatico” dove le cellule non sono osservate dall’occhio umano ma da un rilevatore elettro- nico. In fi gura 1 è schematizzata la struttura di un citofl uorimetro. La sospensione cellulare è inviata al rilevatore dal sistema fl uidico della macchina che, grazie ad uno specifi co design e a pompe di precisone, riesce a porre cellule in un fl usso ordinato. Le cellule attraversano la camera di rilevazione ove sono presenti uno o più fasci luminosi. Il passaggio delle cellule attraverso la luce genera dei segnali che so- no captati ed amplifi cati da speciali rilevatori. I primi segnali che le particelle generano, do- vuti al mero attraversamento del fascio lumi- noso, sono detti “parametri fi sici” e danno in- formazioni sul numero, dimensione e morfolo- gia delle cellule, diff erenziando lieviti da batteri od una coltura pura di lieviti da una coltura mi- sta (fi g. 2). Grazie ad apposite sostanze, dette fl uorofori, è possibile poi evidenziare specifi - che caratteristiche della popolazione cellulare tra cui la vitalità, l’attività metabolica o, in casi particolari, la specie di origine.
La Fondazione Mach vanta una lunga tradizio- ne nel campo dell’analisi e della consulenza nel settore enologico, sia in campo chimico che microbiologico.
FIG. 2Popolazione
cellulare mista di lieviti Saccharomyces e Brettanomyces, diff erenziate mediante osservazione dei parametri fi sici al citofl uorimetro
FIG. 3 Risultati della
comparazione tra analisi citofl uorimetrica e tradizionale, mediante coltura su piastra, di LSA. Andamento dei risultati, in blu le conte su piastra e in rosso la conta citofl uorimetrica. I risultati di quest’ultima rientrano nell’intervallo di incertezza della conta su piastra (linee nere)
Rispondendo a questa sua vocazione ha ac- quisto, sulla base delle prospettive descritte, un apparato citofl uorimetrico ed è ora in grado di fornire una serie di servizi analitici basati sul- la citofl uorimetria.
La prima applicazione testata è stata quella dell’analisi dei lieviti secchi attivi. Da molti anni la Fondazione Mach è attiva nella caratteriz- zazione di questo strumento enologico, grazie anche ad un marchio di qualità.
Nel corso del 2013 sono stati analizzati più di 80 campioni di lievito secco attivo, com- parando la determinazione delle cellule con il citofl uorimetro alla conta su piastra secondo metodo uffi ciale OIV. Le determinazioni otte- nute al citofl uorimetro rientrano nell’intervallo di incertezza della conta su piastra (fi g. 3), inoltre l’analisi al citofl uorimetro dà informazio- ni sul numero delle cellule morte presenti nel
FIG. 2
FIG. 3
UNA LUCE IN CANTINA. APPLICAZIONE DELLA CITOFLUORIMETRIA AL MONITORA
GGIO
MICRObIOLOGICO DEL PROCESSO DI vINIFICAZIONE
FSC SSC 100 101 102 103 104 105 100 101 102 103 104 105
106
lievito secco, un indice della qualità del prepa- rato e degli stress che questi ha subito duran- te il processo di produzione e conservazione. Rispetto alla conta su piastra siamo quindi in grado di ottenere maggiori informazioni in mi- nor tempo: l’analisi al citofl uorimetrica richiede 30 minuti, rispetto ai 3-4 giorni necessari con la conta su piastra.
Una seconda applicazione in campo enolo- gico è il monitoraggio della rifermentazione in bottiglia durante la produzione di vini spumanti metodo classico. È noto che la fermentazione secondaria dei vini spumanti e un processo delicato perché avviene in un mezzo, il vino, sfavorevole all’attività dei lieviti.
Il monitoraggio della microfl ora durante la pro- duzione del piede di avviamento e nelle prime fasi della fermentazione in bottiglia è importan- te e deve essere tempestiva visti i tempi brevi di tale processo.
La citofl uorimetria si presenta, anche in que- sto caso, come una interessante alternativa. Mediante l’impiego di soluzioni fl uorescenti è possibile discriminare le cellule vive dalle cel- lule morte. Dall’incrocio dei due segnali fuo- ruscenti è possibile ottenere diagrammi come quello rappresentato in fi g. 4 dove si diff eren- ziano sia la popolazione di cellule vive che di cellule morte. Ma l’analisi di vini spumanti in rifermentazione ci fornisce altre informazioni. È possibile identifi care una terza popolazione cellulare di lieviti ancora attivi ma che presen- tano rilevanti danni alla membrana cellulare. L’incidenza di queste cellule sulla popolazione di lieviti è un indice dello stato della biomas- sa e può consentire di prevenire arresti di fer- mentazione. Anche in questo caso quindi la citofl uorimetria è in grado di fornire risposte accurate ed esaustive in tempi molto rapidi, nell’ordine della ventina di minuti.
Le applicazioni descritte rappresentano due risposte concrete e immediatamente dispo- nibili alle problematiche inerenti la gestione delle biomasse in enologia. La citofl uorimetria ha numerose altre applicazioni che saranno sviluppate prossimamente tra cui la ricerca di lieviti alterativi e il monitoraggio della fermenta- zione malolattica.
Nel settore della microbiologia enologica si sta quindi aff acciando una generazione di appara- ti strumentali in grado di fornire strumenti per la comprensione delle dinamiche delle popola- zioni microbiche durante il processo di vinifi ca- zione a vantaggio della qualità delle produzioni enologiche.
FIG. 4Caratterizzazione dello stato di vitalità di una popolazione di lieviti in fermentazione in uno spumante durante la presa di spuma in bottiglia
FIG. 4 SPUMANTE IN RIFERMENTAZIONE Analisi citofluorimetrica FL2 FL1 100 101 102 103 104 105
UNA LUCE IN CANTINA. APPLICAZIONE DELLA CITOFLUORIMETRIA AL MONITORA
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