8.1 Reazione di PCR per la creazione delle sequenze relative alle proteine da fondere a GFP
Le reazioni di PCR che sono state assemblate sono due: la prima è servita ad amplificare la regione di TbSP1 che codifica per il dominio corrispondente a quello rimosso nella proteina Del2 (chiamato per semplicità Del2N, ad indicare che si tratta della regine N-terminale), la seconda ha prodotto una sequenza di TbSP1 priva di codone di stop. Ciò è necessario perché la fusione con GFP avviene al C-terminale della proteina.
Come templato è stato utilizzato il cDNA di TbSp1; i primer usati sono riportati in figura 31.
Del2N:
TbSP1-GNAE-plus 5’ ggaaacgctgaggttattgc 3’ Tm= 60 °C Del2-minus 5’ gccagggttcttattgcgc 3’ Tm= 60 °C
TbSp1(-STOP):
TbSP1-GNAE-plus 5’ ggaaacgctgaggttattgc 3’ Tm= 60 °C TbSP1(-Stop)-minus 5’ caaccaaccgaacgtgcg 3’ Tm= 58 °C
Figura 31: Sequenze degli oligonucleotidi utilizzati per l’amplificazione dei cDNA codificanti per le proteine Del2N e TbSP1.
Si sono ottenuti un amplicone di 264 bp per Del2N e uno di 540 bp per TbSP1(-STOP).
8.2 Clonaggio degli ampliconi nel vettore pET28bG-Tromb-GFP-His
Il vettore pET28bG-Tromb-GFP-His è stato utilizzato per l’introduzione delle sequenze Del2N e TbSP1(-STOP): il risultato è un vettore per l’espressione delle proteine di fusione, rispettivamente Del2N-GFP e TbSP1-GFP.
Il clonaggio è stato effettuato nel sito PmeI utilizzando il metodo “Bolcloning” (figura 28).
I costrutti così ottenuti sono stati utilizzati per la trasformazione di cellule elettro-competenti Bl21 CodonPlus (DE3) di Escherichia coli.
Il passaggio successivo prevede l’identificazione dei cloni che hanno acquisito il vettore con l’inserto; sarà poi possibile esprimere in grandi quantità e purificare le proteine di fusione, e utilizzarle per il saggi di localizzazione.
Da questo saggio ci si aspetta di determinare se il dominio N-terminale di TbSP1, contenente il motivo RGD, è davvero coinvolto nella localizzazione a livello della parete cellulare.
CONCLUSIONI
Le conclusioni che si possono trarre dal presente lavoro di tesi sono relative soprattutto alla prima parte del lavoro svolto.
Due varianti di TbSP1 mutate per delezione sono state progettate in modo che fossero rimossi un dominio N-terminale che TbSP1 mostra in più rispetto alle altre fosfolipasi (Del1) e una regione ancora più estesa e poco conservata tra le fosfolipasi del gruppo XIV (Del2). I saggi condotti su tali mutanti, per valutare le conseguenze delle delezioni sull’attività, hanno portato a risultati interessanti.
Prima di tutto, è stata in parte confermata l’osservazione fatta in precedenti lavori, secondo cui la riduzione della regione N-terminale di TbSP1 comporta un aumento nell’attività enzimatica. I risultati ottenuti per Del1, infatti, dimostrano un incremento notevole della percentuale di acido grasso rilasciato se paragonata a quella della proteina wild type, sia essa con o senza His-tag. È possibile che la presenza di un dominio N-terminale in TbSP1 mascheri in parte il sito catalitico, rendendo più difficile il legame del substrato; la sua riduzione o rimozione si tradurrebbe quindi in una aumentata attività. Oltre al coinvolgimento nel legame della parete, quindi, si può ipotizzare per tale dominio un ruolo nella regolazione dell’attività enzimatica, forse mediata dall’interazione con altri fattori presenti a livello della parete.
Il confronto tra le due forme di Del1 (con e senza coda istidinica), invece, non evidenzia differenze notevoli: è possibile che, anche in presenza dell’His-tag, il sito di legame del substrato sia già sufficientemente libero, perciò la presenza o assenza del tag è irrilevante ai fini dell’attività. Queste ipotesi potranno essere verificate o smentite solo quando saranno disponibili informazioni complete sulla struttura di TbSP1 e si saranno ottenuti cristalli idonei all’analisi diffratometrica anche per Del1.
In secondo luogo, la rimozione di una sequenza aminoacidica maggiore dall’N-terminale di TbSP1 porta ad una perdita totale di attività. Le spiegazioni che si possono fornire sono due: la rinaturazione mediante dialisi, durante la fase di purificazione, non è avvenuta in maniera efficiente oppure la mutazione è tale da impedire il corretto ripiegamento della proteina. Rimane da verificare quale dei due casi stia alla base dell’inattività, ma c’è una maggiore propensione per la seconda delle due ipotesi.
dubitare che non sia andata bene anche per Del2. Inoltre, considerando la struttura di Del2, dedotta a partire dalla struttura parzialmente nota di TbSP1 (figura 17), si può facilmente ipotizzare un mancato ripiegamento del loop di legame del calcio: è possibile che il ponte disolfuro da solo, in assenza delle due eliche del dominio precedente, non sia in grado di mantenere il loop nella giusta posizione. Un folding errato comporterebbe l’incapacità di legare lo ione calcio e, quindi, di svolgere l’attività fosfolipasica.
In relazione alla seconda parte del lavoro svolto, ancora poco si può dire sui risultati.
Fino ad ora è stata ottenuta con successo l’espressione e la purificazione della proteina GFP, inoltre è stato fatto il clonaggio delle sequenze che codificano per le proteine di fusione. Sono in corso le prove di espressione di tali proteine e verranno presto purificate, per essere utilizzate nel saggio di localizzazione. Si spera, così, di fare luce sul ruolo del dominio N-terminale di TbSP1 e sul coinvolgimento del motivo RGD nel legame alla parete cellulare.
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RINGRAZIAMENTI
Ebbene sì, anche per me è giunta l’ora dei ringraziamenti… quasi non mi sembra vero, significa che sono arrivata sana e salva in fondo a questi cinque anni di università!!
Ringrazio prima di tutti il Prof. Rossi per avermi illuminato la strada, facendomi capire
“cosa voglio fare da grande”, e per avermi dato l’occasione di cominciare a percorrerla.
Un enorme grazie va ad Angelo per avermi seguito (o forse dovrei dire per essere stato seguito, anzi pedinato da me) in tutti questi mesi, a Roberto V., Davide C., Roberto F. e Chicco per i continui supporti tecnici ed informatici…mi avete salvata in più di un’occasione!!
Che dire poi dei tanti compagni di studi, per merito dei quali ho sopportato meglio la lontananza da casa e dal mio lago?! Davide, Fabi, Marci, Vale, Fede, Mikol, Sara, Lodo, Ugo, Gabri, Chicco, Carlo, Luca, Flavio, Shanis, Mara…e tanti altri ancora (scusate se non vi nomino tutti, non posso scrivere 10 pagine di ringraziamenti!)…ho trascorso con voi anni indimenticabili e dire che sono volati è poco! Un ringraziamento particolare poi va a Nicola e Giordana: non so cosa avei fatto senza di voi, il vostro sostegno e il vostro affetto…non ho parole per dirvi quanto vi voglio bene!
Non posso dimenticare le coinquiline che mi hanno tenuto compagnia durante questa avventura parmigiana: Christina, Sabela, Silvia, Federica, Michela, Paola, Chiara, Elena e Francesca…grazie per “George Clooney”, la paella, le risate, le uscite, i regali
“muccati”, il tè delle cinque e la camomilla delle dieci, Santa Lucia, le partite di carte al lume di candela…
Infine il mio grazie più sentito va alla mia famiglia (mamma, papà e la mia “sorellina”
Annamaria) per avermi dato la possibilità di realizzare i miei desideri e per essermi sempre stata vicina, soprattutto nei momenti di crisi…non sarò mai in grado di sdebitarmi per tutto ciò che mi avete dato e avete fatto per me…grazie di cuore!