Reazione di PCR per la creazione dei mutanti per delezione
Per ottenere i mutanti viene usata una coppia di primer (plus e minus) tale per cui l’amplificazione sia limitata ad una porzione della sequenza di TbSP1.
Reazione assemblata per la creazione di Del1:
DNA TbSP1 (10 ng/µl) 1.0 µl
Pfu buffer 10x 5.0 µl
Pfu DNA polimerasi (2 U/µl) 0,5 µl Primer TbSP1-Del1-plus (25 µM) 1.0 µl Primer CpO_TbSP1-minus (25 µM) 1.0 µl
dNTP (2.5 mM) 6.0 µl
H20 35.5 µl
Totale 50.0 µl
La reazione avviene nelle seguenti condizioni:
94 °C 94°C
3’ 45”
72 °C 72 °C 1’ 10’
55 °C
45”
4°C 25 cicli ∞
La stessa reazione viene assemblata anche per la creazione del mutante Del2, usando il corrispondente primer TbSP1-Del2-plus e il primer CpO_TbSP1-minus.
Reazione di PCR per la creazione dei domini di fusione con GFP I primer utilizzati in questa reazione sono:
- TbSP1-GNAE-plus e TbSP1(-STOP)-minus per ottenere la sequenza di TbSP1 priva del codone di stop;
- TbSP1-GNAE-plus e Del2-minus per amplificare la porzione di TbSP1 rimossa nel mutante per delezione Del2 (chiamata Del2N).
Le condizioni di reazione sono le stesse usate nella reazione precedente.
Elettroforesi su gel di agarosio ed eluizione delle bande
Le bande corrispondenti agli ampliconi sono separate mediante un’elettroforesi su gel di agarosio al 2%.
Preparazione del gel
- Sciogliere l’agarosio nel tampone TAE 1x (40 mM Tria-acetato, 1 mM EDTA);
- aggiungere bromuro di etidio 20x;
- versare la soluzione nel supporto, in cui è stato precedentemente inserito un pettine per formare i pozzetti;
- lasciar solidificare il gel.
Preparazione dei campioni
- Aggiungere una soluzione addensante e colorante, data da glicerolo 10%, blu di bromofenolo e xilene cianolo.
La corsa viene fatta avvenire nell’apposita vaschetta in presenza di tampone TAE 1x ed è effettuata a 50 mA.
Le bande corrispondenti agli ampliconi sono excise dal gel ed il DNA è eluito utilizzando il “QIAquick Gel Extraction Kit” (QIAGEN), seguendo il protocollo fornito dal produttore.
Clonaggio nel vettore pET28-pme e pET28bG-Tromb-GFP-His con il sistema
“Bolcloning”
I vettori pET28-pme (5401 bp) e pET28bG-Tromb-GFP-His (6190 bp) presentano nella loro sequenza: un gene lacI, che codifica per il repressore lac; un gene per la resistenza alla kanamicina; un sito di clonaggio multiplo posto sotto il controllo del promotore forte della RNA polimerasi T7.
La RNA Pol T7 è trascritta a partire da un gene cromosomale delle cellule trasformate ed è controllato dal promotore lacUV5: questo promotore è insensibile all’inibizione da galattosio, ma è inducibile da lattosio o analoghi come l’isopropyl-β-D-tiogalattopiranoside (IPTG). È possibile, quindi, indurre la sovraespressione della proteina clonata nel vettore mediante aggiunta di IPTG alla coltura batterica.
Sistema Bolcloning (dati non pubblicati)
Per il clonaggio è stata messa a punto una reazione unica di apertura del vettore e inserimento del frammento: nella soluzione, infatti, sono presenti contemporaneamente l’enzima di restrizione e la ligasi. Il sistema Bolcloning è più veloce dei protocolli precedentemente utilizzati e ha una buona percentuale di riuscita.
La reazione viene effettuata in modo che il rapporto vettore: inserto sia di 1:10.
La soluzione di reazione per il clonaggio di Del1 e Del2 è così composta:
Vettore pET28-pme (50 ng/µl) 1 µl
Inserto (50 ng/µl) 1.5 µl
SnaBI 0.2 µl
Buffer 4 10x 1 µl
T4 DNA Ligasi (5 U/µl) 0.5 µl
ATP (10 mM) 1 µl
BSA 10x 1 µl
H2O 3.8 µl
Totale 10.0 µl
La reazione è incubata a 37 °C per 1h; al termine dell’incubazione, per inattivare la T4 DNA ligasi, la reazione è posta a 65 °C per 10 minuti. Infine, si aggiungono 50 µl di H2O: questo passaggio serve per diluire il sale contenuto nella soluzione senza dover fare dei lavaggi prima della trasformazione per elettroporazione.
La stessa reazione è stata assemblata per l’introduzione di TbSP1(-STOP) e Del2N nel vettore pET28bG-Tromb-GFP-His; è stato usato utilizzato il sito di clonaggio PmeI.
Trasformazione mediante elettroporazione Preparazione delle cellule elettrocompetenti
- Mettere in Eppendorf in aliquote da 1.5 ml le cellule provenienti da una coltura fresca arrivata a 0.6 OD600;
- centrifugare per 1’ e risospendere il pellet in 1 ml di H2O sterile;
- centrifugare di nuovo e ripetere il lavaggio con H2O sterile altre due volte;
- risospendere il pellet nella goccia rimanente.
Le cellule, a questo punto, possono essere usate oppure congelate in azoto liquido e conservate a –80 °C (le aliquote sono da 20 µl circa). Al momento dell’utilizzo, le aliquote provenienti da –80 °C vanno scongelate in ghiaccio.
Elettroporazione
- Aggiungere 1-1.5 µl della reazione di ligazione alle cellule e mescolare pipettando delicatamente;
- trasferire la soluzione nella cuvetta da elettroporazione, conservata in ghiaccio;
- applicare una scarica elettrica;
- raccogliere le cellule in 1 ml di terreno SOC o LB;
- incubare le cellule a 37 °C per 1h;
- seminare le cellule su una piastra data da LB-agar e gli antibiotici necessari, e lasciar crescere le cellule a 37 °C o/n.
Lo strumento utilizzato per la trasformazione è il Micro Pulser™ (Bio Rad), impostato su EC1 (= E. Coli, cuvette con elettrodi ad una distanza di 1 mm).
Trasformazione chimica
Preparazione delle cellule chimico-competenti
- Preparare 1 litro di coltura batterica fresca e aspettare che le cellule crescano fino a 0.4 OD600;
- centrifugare per 10’ a 4000 rpm a 4 °C;
- eliminare il surnatante;
- risospedere il pellet in 600 ml di una soluzione 80 mM MgCl2 e 20 mM CaCl2; - centrifugare a 4000 rpm per 10’ a 4 °C;
- risospendere il pellet in 40 ml di CaCl2 0.1 M;
- aggiungere 1.5 ml di DMSO e lasciare 15’ in ghiaccio;
- ripetere questo passaggio;
- dividere le cellule in aliquote da 40 µl;
- congelare in azoto liquido e conservare a –80 °C.
Trasformazione
- Aggiungere 1-1.5 µl di reazione di ligazione alle cellule competenti;
- lasciare in ghiaccio per 30’;
- incubare a 42 °C per 45”;
- mettere in ghiaccio per altri 5’;
- aggiungere 500 µl di terreno SOC o LB;
- incubare a 37 °C per 1h;
- piastrare le cellule in presenza degli opportuni antibiotici e far crescere a 37 °C o/n.
Miniprep
La procedura di purificazione plasmidica mediante lisi alcalina prevede il seguente protocollo:
- inoculare una singola colonia in 3 ml di LB, a cui sono stati aggiunti gli antibiotici, e lasciar crescere a 37° o/n;
- trasferire in Eppendorf 1.5 ml di coltura, centrifugare e buttare il surnatante;
- ripetere l’operazione aggiungendo i restanti 1.5 ml;
- risospendere il pellet;
- aggiungere 300 µl di Sol I (GTE + Rnasi A 400 µg/ml) e vortexare;
- aggiungere 300 µl di Sol II e mescolare per inversione senza scuotere;
- aggiungere 300 µl di Sol III e mescolare per inversione → si forma un precipitato bianco; mettere in ghiaccio per 5 min e centrifugare a 4° per 10 min;
- prelevare 800 µl di surnatante e mettere in un’altra Eppendorf con 0.6 volumi di isopropanolo (480 µl); vortexare e centrifugare per 10 min a T ambiente;
- versare l’isopropanolo;
- aggiungere 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare per 10 min; versare l’etanolo e lasciare ad essiccare;
- risospendere in 30 µl di H2O e vortexare per 1 min.
COMPOSIZIONE DELLE SOLUZIONI UTILIZZATE
- Soluzione I: Glucosio 50 mM
Tris-HCl 25 mM pH 8.0 EDTA 10 mM pH 8.0
- Soluzione II: NaOH 0.2 N SDS 1% (w/v)
- Soluzione III: Potassio acetato 3 M Acido acetico 5 M
Digestione analitica con enzimi di restrizione per valutare la presenza dell’inserto L’inserto è stato clonato nel vettore pET28-pme utilizzando SnaBI, perciò la digestione analitica è effettuata con un enzima di restrizione che taglia a monte e uno che taglia a valle del sito di clonaggio. Sono stati scelti per lo scopo gli enzimi XbaI e HindIII.
La soluzione di reazione è così formata:
DNA plasmidico 5 µl XbaI (20 U/µl) 0.2 µl HindIII (20 U/µl) 0.2 µl
BSA 10x 2 µl
Buffer 2 10x 2 µl
H2O 10.6 µl
Totale 15.0 µl
La reazione è fatta avvenire a 37 °C per 1h.
I prodotti della digestione sono successivamente analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio all’1.2%; insieme ai campioni è caricato anche un miniprep non digerito da usare come controllo negativo.
Reazione di PCR analitica per valutare la presenza dell’inserto
In alcuni casi non sono stati ottenuti risultati chiari con la digestione con enzimi di restrizione, perciò si è proceduto con una reazione di PCR per ottenere informazioni più precise.
Reazione di PCR
DNA plasmidico 0.5 µl
Taq Home Made buffer 10x 2.5 µl Taq Home Made DNA polimerasi (1 U/µl) 1.25 µl
MgCl2 3 µl
Primer plus (25 µM) 0.5 µl
Primer CpO_TbSP1-minus 0.5 µl
dNTP (2.5 mM) 2 µl
H2O 14.75 µl
Totale 25.0 µl
Il primer plus è TbSP1-Del1-plus per il primo mutante per delezione, TbSP1-Del2-plus per il secondo.
La reazione avviene nelle seguenti condizioni:
94 °C 94°C
3’ 45”
72 °C 72 °C 1’ 10’
55 °C
45”
4°C 25 cicli ∞ I prodotti dell’amplificazione sono caricati su un gel di agarosio al 2%.
Reazione di PCR per valutare l’orientamento dell’inserto
I cloni risultati positivi alla digestione o alla PCR analitica sono sottoposti ad un’ulteriore reazione di PCR per valutare quali hanno l’inserto nel giusto orientamento.
Per ogni campione sono assemblate due reazioni:
- Miniprep di Del1 primer TbSP1-Del1-plus + pET_minus;
primer CpO_TbSP1-minus + pET_minus.
- Miniprep di Del2 primer TbSP1-Del2-plus + pET_minus;
primer CpO_TbSP1-minus + pET_minus.
Il primer pET_minus si appaia ad una regione del vettore che corrisponde al terminatore di T7, perciò è uguale per i due mutanti.
Gli inserti con l’orientamento corretto saranno amplificati nel primo caso, quelli introdotti al contrario saranno amplificati con i due primer minus.
Reazione di PCR
Vedi “Reazione di PCR analitica per valutare la presenza dell’inserto”
Anche le condizioni di reazione sono le stesse, fatta eccezione per la temperatura di appaiamento dei primer (52 °C invece di 55 °C)
I prodotti dell’amplificazione sono poi caricati su un gel di agarosio all’1,2% ed i cloni positivi usati per la trasformazione delle cellule Bl21 CodonPlus (DE3).
Questo passaggio non è necessario nel caso del clonaggio in pET28bG-Tromb-GFP-His poiché negli inserti con orientamento sbagliato si originano dei codoni di stop che impediscono la produzione di GFP: le colonie, perciò, non sono luminose.
3. PROVA DI ESPRESSIONE E DI SOLUBILITÁ
Prova di espressione
- Inoculare una singola colonia di Bl21 CodonPlus (DE3) trasformata in 10 ml di terreno LB e antibiotici (kanamicina e cloramfenicolo) ed incubarla a 37 °C o/n.
- Inoculare 1/100 della coltura in 10 ml di terreno fresco con antibiotici e far crescere a 37 °C fino a che le cellule non raggiungono un OD600 di 0.6-0.7.
- Tenere da parte 1 ml di coltura (campione non indotto) ed aggiungere al resto IPTG 1M sterile fino ad ottenere una concentrazione finale pari a 1 mM.
- Far crescere le cellule per 4h a 37 °C oppure per due giorni a 22 °C.
- Prelevare 0.5 ml di campione indotto e centrifugarlo insieme al campione non indotto a 13000 rpm per 5’ (a 4°); risospendere i pellet in 30 µl di Tris-HCl 10 mM pH 8.0 → saranno analizzati mediante elettroforesi su un gel di poliacrilamide.
- Centrifugare la restante coltura a 3000-3500 rpm per 15’ e lavare il pellet con 1 ml di Tris-HCl 10 mM pH 8.0.
- Risospendere il pellet nel lysis buffer o conservarlo a -20 °C.
Prova di solubilità
- Risospendere il pellet in 1 ml di lysis buffer, così composto:
Tris-HCl 25 mM pH 8.0 NaCl 0.3 M
PMSF 0.5 mM Benzamidina 0.5 mM Leupeptina 1µM Pepstatina 1µM H2O
- Lasciare 10’ a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1.6 µl di Tween 20.
- Sonicare il campione con almeno 7 colpi da 30” ciascuno, con pause di 3-5’ tra un colpo e quello successivo.
- Centrifugare per 15 min e tenere da parte il surnatante; risospendere il pellet in 1 ml di lysis buffer.
- Prelevare 30 µl da entrambi i campioni → saranno analizzati mediante elettroforesi su un gel di poliacrilammide.
Elettroforesi su gel di poliacrilammide per la separazione di proteine Un gel di acrilammide al 15% è così costituito:
- RUNNING GEL
Running gel buffer 4x 1.25 ml
Acrilammide 30% 2.5 ml
SDS 10% 50 µl
APS 10% 40 µl
H2O 1.16 ml
TEMED 8 µl
- STACKING GEL
Stacking gel buffer 4x 750 ml
Acrilammide 30% 400 ml
SDS 10% 30 µl
APS 10% 30 µl
H2O 1.73 ml
TEMED 6 µl
Preparazione del gel
- Versare il running gel in una camera formata da due lastre di vetro, tenute ad una distanza di 1 mm grazie a degli spacers, e chiusa sul fondo dall’apposito supporto.
- Aggiungere dell’isopropanolo in modo che si formi un menisco piatto.
- Quando il running gel è solidificato, togliere l’isopropanolo, versare lo stacking gel e posizionare il pettine per formare i pozzetti.
Una volta preparato il gel, questo verrà montato nell’apposita cella elettroforetica
Preparazione dei campioni
- Aggiungere ai campioni ottenuti dalla prova di induzione e/o dalla prova di solubilità 15 µl di SB (4x);
- bollire i campioni per 10-15’ a 100 °C in modo da denaturare le proteine;
- caricare i campioni sul gel.
La corsa viene effettuata a 20 mA.
Trattamento del gel dopo la corsa
- Togliere il gel dal supporto aiutandosi con dell’acqua;
- lasciare il gel immerso in una soluzione colorante per almeno 30’;
- sostituire la soluzione colorante con una decolorante e lasciarvi il gel immerso per almeno 30’.
COMPOSIZIONE DELLE SOLUZIONI UTILIZZATE PER IL GEL
- Runnig gel buffer 4x: Tris 36.3 g
H2O fino a 200 ml
La soluzione deve essere portata ad un pH pari a 8.8 con HCl.
- Stacking gel buffer 4x: Tris 6 g
H2O fino a 100 ml
La soluzione va portata ad un pH pari ad 6.8 con HCl.
- Acrilammide 30%: Acrilammide 58.4 g
Bisacrilammide 1.6 g
H2O fino a 200 ml
- Tampone elettrodico: Tris 3 g
Glicina 18.8 g
SDS 10% 10 ml
Portare ad 1 litro con H2O distillata.
- Soluzione colorante: Coomassie Brilliant Blue 0.5 g
Acido acetico 14 ml
Etanolo 100 ml
Portare a 200 ml con H2O distillata.
- Soluzione decolorante: Acido acetico 20 ml
Etanolo (96%) 40 ml
Portare a 200 ml con H2O distillata.
- SB 4x: Stacking gel buffer 2 ml
SDS 10% 4 ml
β-mercaptoetanolo 400 µl
Blu di bromofenolo 600 µl
Glicerolo 100% 2.4 ml
Portare a 10 ml con H2O distillata.
4. ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DAI CORPI DI INCLUSIONE
Espressione
Per il protocollo vedi “prova di espressione”: la stessa procedura viene applicata ad un litro di coltura.
Sonicazione
La procedura di sonicazione è diversa rispetto a quella utilizzata nelle prove di solubilità, in quanto la proteina si è rivelata essere insolubile. Nel caso della purificazione dai corpi di inclusione viene usato il seguente protocollo:
- risospendere in 50 ml di Tris-HCl 20 mM pH 8,.0 il pellet ottenuto dalla centrifugazione di un litro di coltura indotta;
- sonicare la soluzione con 12 colpi da 30’ ciascuno, con pause di 3-5’ tra colpi successivi;
- prelevare 1 ml di soluzione e centrifugare a 13000 rpm per 15’; tenere da parte il surnatante, risospendere il pellet in 1 ml di Tris-HCl 10 mM pH 8.0 e prelevare 30 µl di ciascuno da caricare su gel;
- centrifugare il resto del campione a 10000 rpm per 10’;
- risospendere il pellet in 50 ml di una soluzione fredda data da:
Tris-HCl 20 mM pH 8.0 NaCl 0.5 M
Urea 2 M
Triton™ X-100 2%
- ripetere la sonicazione con le stesse modalità;
- prelevare nuovamente 1 ml di campione da caricare su gel;
- centrifugare a 10000 rpm per 15’ e lavare il pellet con altri 50 ml della soluzione con urea.
Dialisi
Il campione proteico isolato dai corpi di inclusione viene sottoposto a denaturazione e lenta rinaturazione mediante dialisi.
Preparazione del campione
Il pellet proveniente dalla sonicazione viene risospeso in 10 ml di una soluzione così composta:
Tris-HCl 20 mM pH 8.0 NaCl 0.5 M
Guanidinio idrocloruro 6 M β-mercaptoetanolo 1 mM
e viene lasciato in agitazione a temperatura ambiente per 30-60’.
Il campione è poi centrifugato a 13000 rpm per 15’ a 4 °C ed il surnatante è tenuto da parte.
Preparazione dei tubi da dialisi
Vengono usati tubi da dialisi con un cut off di 3500 ed un diametro di 16.0 mm.
- Tagliare un pezzo di tubo sufficientemente lungo da contenere i 10 ml di surnatante e consentire la chiusura alle estremità;
- far bollire il tubo per 10’ in 500 ml di una soluzione di sodio bicarbonato al 2%
(w/v) ed EDTA 1mM (pH 8.0);
- sciacquare bene il tubo con acqua distillata;
- far bollire altri 10’ in 500 ml di una soluzione 1 mM EDTA (pH 8.0);
- lasciar raffreddare il tubo e infine sciacquarlo bene con acqua distillata, sia all’esterno sia all’interno.
A questo punto, si annoda un’estremità del tubo, si introduce il campione e si chiude anche l’altra estremità. Il sacchetto è posto in agitazione in 2 litri di un buffer dato da:
Tis-HCl 20 mM pH 8.0 NaCl 0.5 M
Urea 6 M
La fase di rinaturazione prevede un graduale passaggio da 6 M urea a 0 M urea, perciò ogni ora la soluzione di dialisi viene sostituita con una a concentrazione più bassa di urea. La soluzione senza urea viene lasciata o/n.
Il campione viene, infine, estratto dal sacchetto e centrifugato per separare il surnatante dal precipitato che si è formato; sul surnatante viene poi fatta una stima della concentrazione di proteina mediante il saggio di Bradford.
Non sono state usate ulteriori procedure di purificazione in quanto il campione, dal gel dopo la sonicazione, è risultato sufficientemente puro.
Saggio di Bradford
Il metodo si basa sull’interazione non covalente di un colorante con le proteine: il colorante lega principalmente residui basici e questa interazione comporta uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 495 a 595 nm. Misurando spettrofotometricamente l’aumento dell’assorbimento a 595 nm e costruendo una retta di taratura con soluzioni a concentrazione nota di siero-albumina bovina (BSA), è possibile stimare la concentrazione proteica del campione di interesse.
La soluzione utilizzata per il saggio è fornita dal kit Bio-Rad ed è data da:
Etanolo 95%
Acido fosforico 88%
Colorante Serva Blu G
5. ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE MEDIANTE CROMATOGRAFIA D’AFFINITÁ
Espressione
Per il protocollo vedi “prova di espressione”: la stessa procedura viene applicata a 100 ml di coltura.
Sonicazione
Per il protocollo vedi “prova di solubilità”: viene usata la stessa procedura, risospendendo il pellet in 20 ml di lysis buffer.
Purificazione mediante cromatografia d’affinità
Il vettore pET28bG-Tromb-GFP-His porta alla produzione di proteine con una coda di istidine (6His-tag) all’estremità carbossilica. Il tag consente la purificazione della proteina di interesse mediante cromatografia di affinità con resine al nichel o al cobalto, grazie all’interazione specifica delle istidine con questi ioni.
Per la purificazione viene usate la Talon Metal Affinity Resin (CLONTECH), che sfrutta l’affinità delle istidine per lo ione Co2+ e consente di ottenere in un unico passaggio cromatografico un campione puro all’80%.
Il protocollo di purificazione prevede i seguenti passaggi:
- usare 2 ml di resina e far eluire l’etanolo dalla colonna;
- lavare con 10 ml di acqua ed equilibrare lavando con il tampone di lisi;
- quando il tampone è uscito quasi completamente, risospendere la resina e aggiungerla al surnatante della sonicazione;
- incubare per 1h in rotazione costante a 4°;
- rimettere la sospensione nella colonna e aspettare che la resina si impacchi;
- lavare 3 volte con il tampone di lisi;
- effettuare un lavaggio con il tampone di lisi e imidazolo 10 mM, e raccogliere frazioni da un 1 ml;
- eluire usando il tampone di lisi e imidazolo 200 mM; l’eluato è raccolto in frazioni da 0.5 ml;
- lavare la colonna con il tampone di lisi e infine aggiungere etanolo al 20 %;
conservare la colonna a 4°;
- effettuare il saggio di Bradford sulle frazioni eluite per stimare la concentrazione proteica.
Un’aliquota delle frazioni viene caricata su un gel di poliacrilammide per verificare la purezza dei campioni; le frazioni vengono poi unite.
Scambio del solvente e concentrazione del campione proteico mediante ultrafiltrazione
In alcune occasioni si rende necessario l’utilizzo di mini-concentratori VIVASPIN 5000 MWCO PES (Sartorius): sono cartucce per ultrafiltrazione che consentono la concentrazione della proteina e lo scambio del tampone in cui si trova.
All’interno della cartuccia viene caricata la soluzione proteica e si applica il seguente procedimento:
- centrifugare a 13000 rpm fino a ridurre il volume di 10 volte;
- aggiungere il tampone desiderato (in genere Tris-HCl 25 mM pH 8.0) fino a tornare al volume iniziale;
- centrifugare nuovamente a 13000 rpm fino a raggiungere il volume desiderato.
In questo modo è possibile concentrare il campione proteico, ottenendo però una diluizione di circa 100 volte dei soluti presenti nella soluzione di partenza.
6. RIMOZIONE DELL’HIS-TAG
Il clonaggio nel vettore pET28-pme ha portato alla produzione di proteine con una coda di istidine (6His-tag) all’estremità amminica. Il tag consente la purificazione della proteina di interesse mediante cromatografia di affinità con resine al nichel o al cobalto, grazie all’interazione specifica delle istidine con questi ioni. La cromatografia non è stata utilizzata per le due proteine mutanti poiché sono state ottenute praticamente pure dai corpi di inclusione.
Il clonaggio è fatto in modo tale che nel punto di fusione tra proteina e 6His-tag ci sia un sito di clivaggio riconosciuto dall’enzima proteolitico trombina.
Prima di procedere alla digestione del campione, è stato fatto un saggio analitico con diversi rapporti trombina/proteina (unità/µg). Si sono testati i rapporti : 1U/50µg, 1U/100µg, 1U/150µg e 1U/200µg e la reazione è stata condotta sia a 37 °C per 1h sia a 4 °C o/n.
Le condizioni ottimali per il completamento della digestione e la stabilità in soluzione della proteina digerita prevedono che la reazione avvenga a 4 °C o/n con un rapporto di 1U trombina/50µg proteina.
La reazione finale perciò è:
Tris-HCl 0,25 M 228 µl (concentrazione finale 25 mM : in parte deriva dal buffer di dialisi in cui si trova la proteina e in parte è aggiunto) NaCl 0,16 M / / (si ottiene per diluizione del buffer della proteina) Del1 (3 mg/ml) 900 µl
Trombina (1U/µl) 54 µl
H2O 1.818 ml
Totale 3 ml
La reazione è lasciata a 4 °C o/n. Il normale protocollo di digestione prevede l’inattivazione della trombina mediante aggiunta di PMSF 0.5 mM e incubazione a 37°C per 15’; a causa della scarsa stabilità della proteina e, poiché la presenza della trombina non influisce sui saggi successivi, questo passaggio viene tralasciato.
Per verificare l’avvenuta digestione si prelevano 30 µl della reazione prima e dopo
7. SAGGI DI ATTIVITÁ DELLA FOSFOLIPASI
Preparazione del substrato
1. Fosfolipide marcato radioattivamente
- Essiccare in speed-vac il fosfolipide radioattivo (1.8 µl all’attività specifica di 25 * 10-3 µCi/µl);
- aggiungere un po’ d’acqua (due volte il volume del fosfolipide marcato);
- essiccare in speed-vac;
- risospendere in 34 µl di H2O + 0.1% Triton
2. Fosfolipide non marcato
- Preparare una soluzione stock 100 mM toluene;
- essiccare 2 µl di fosfolipide 100 mM in speed-vac;
- aggiungere un po’ d’acqua (es. 10 µl);
- essiccare in speed-vac;
- risospendere in 200 µl di H2O + 0.1% Triton in modo da ottenere una soluzione a concentrazione 1 nmole/µl.
Reazione
Concentrazione finale Fosfolipide radioattivo (25 * 10-3 µCi/µl) 34.0 µl
Fosfolipide non mercato (1 nmole/µl) 6.0 µl 0.04 mM
40.0 µl
Triton 20x (2%) 5.5 µl
NaCl 3M 7.1 µl 140 mM
HEPES 100 mM pH 8.0 30.0 µl 20 mM
CaCl2 1 M 4.5 µl 30 mM
H2O 44.8 µl
Enzima (Del1) 1.1 µg/µl 18.1 µl 0.13 µg/µl
Totale 150 µl
Procedura
- Incubare la reazione a 30 °C per 1h;
- Incubare la reazione a 30 °C per 1h;