Controllo interno di estrazione

Per la messa a punto della metodica NAT in-house, è stato scelto come controllo interno di estrazione/amplificazione il virus BVDV. Tale virus è stato selezionato in quanto rappresenta un substrato ottimale per le seguenti caratteristiche:

 possiede, come HEV, un genoma ad RNA e quindi può facilmente essere co-estratto utilizzando lo stesso kit di estrazione impiegato per il virus target e successivamente amplificato nella stessa reazione di RT-PCR

 è un virus appartenente alla famiglia Flaviviridae, filogeneticamente distante da HEV, condizione ottimale per lo sviluppo di una reazione multiplex

 non infetta l’uomo e quindi non costituisce un rischio per gli operatori, né può essere presente nel campione iniziale da sottoporre alla ricerca di HEV

 stock di BVDV sono prodotti di routine nel laboratorio in cui è stata messa a punto la metodica (BioSC) e sono ampliamente caratterizzati per purezza ed identità di sequenza, oltre che testati per infettività

Propagazione e valutazione infettività BVDV

Il BVDV è un virus a RNA, rivestito, appartenente al genere Pestivirus, famiglia Flaviviridae. Il BVDV viene utilizzato come modello per il virus dell’epatite C negli studi di inattivazione e rimozione virale e per tale scopo viene propagato per ottenere stock virali ad alto titolo infettivo

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(106-109 log TCID50/ml). Questo virus infetta in maniera produttiva la linea cellulare MDBK,

costituita da cellule epiteliali di derivazione bovina, causando un’estensiva distruzione del tappeto cellulare.

Propagazione cellule MDBK

Le aliquote delle cellule vengono conservate in azoto liquido e vengono scongelate circa due settimane prima del momento previsto di utilizzo.

Prima di effettuare lo scongelo, il terreno di coltura completo viene tolto dal frigo e viene riscaldato a temperatura ambiente. Una volta prelevata la vial di cellule dal contenitore criobiologico, viene trasportata mediante rack refrigerato nell’area dove avviene lo scongelamento. Per effettuare uno scongelamento rapido, necessario per mantenere una alta vitalità delle cellule che sono a contatto con il DMSO, la vial viene trasferita in un bagnetto a 37°C. Appena scongelato l’intero contenuto della vial viene trasferito in una provetta da centrifuga, viene diluito 1:10 in terreno di coltura completo e viene centrifugato per 5-10 minuti a 193 rcf con conseguente formazione del pellet. In seguito viene scartato il surnatante, il pellet viene risospeso in terreno di coltura completo fresco (12-14 ml per flask da 75 cm2, 30-32 ml per flask da 150 cm2) nei volumi. Le cellule vengono incubate poi a 37°C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.

Il terreno utilizzato per la propagazione della linea MDBK è l’EMEM, il quale viene preparato secondo la seguente modalità:

 Scongelare un’aliquota da 50 ml di HS e la soluzione di antibiotici (penicillina/streptomicina)

 Portare a temperatura ambiente una bottiglia di EMEM da 500 ml  Centrifugare 50 ml di HS a 557 rcf per 10 minuti

 Rimuovere e scartare 52,5 ml di EMEM dalla confezione di 500 ml  Aggiungere 50 ml di HS pre-centrifugato

 Aggiungere 2,5 ml della soluzione di antibiotici

In questo modo si ottiene il terreno di coltura completo contenente il 10% di siero, 50 UI/ml di penicillina e 50 µg/ml di streptomicina.

Per la propagazione delle MDBK viene rimosso tutto il terreno di coltura ed in seguito viene aggiunto PBS in modo tale da bagnare e lavare tutto il tappeto cellulare. Rimosso il PBS viene aggiunta Tripsina, una volta bagnato tutto il tappeto cellulare si lascia agire per 30-40 secondi e si rimuove completamente. La fiasca viene trasferita nell’incubatore al 5% di CO2 a 37°C per 2-4

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dalla fiasca. Le cellule vengono propagate in modo da avere una quantità adeguata, necessaria per la propagazione, effettuando uno split da 1:5 a 1:25, o per la titolazione.

Propagazione virus

Il giorno prima dell’infezione si inoculano le cellule MDBK in una o più fiasche da coltura alla densità di 20000-26800 cellule per cm2 e si ripongono nell’incubatore al 5% di CO2 e alla

temperatura di 37°C.

Il giorno dell’infezione si scongela una aliquota di BVDV a titolo noto. Si infettano con lo stesso le cellule inoculate il giorno precedente con una molteplicità di infezione (m.o.i.) pari a 0,5-1 PFU. Per ottenere l’m.o.i. ottimale viene effettuata un’opportuna diluizione dello stock di virus originale, utilizzando come diluente il terreno di coltura completo delle MDBK. Se il titolo del virus è riportato in TCID50/ml si utilizza la seguente conversione per conoscere la concentrazione

in PFU/ml:

Prelevata la fiasca di cellule dall’incubatore e portata sotto cappa, viene rimosso completamente il terreno di coltura e successivamente viene inoculato la quantità opportuna di virus in terreno di coltura completo in un volume di 4 ml per fiasche da 75 cm2 o 10 ml per fiasche da 150 cm2. La fiasca viene fatta oscillare delicatamente in modo da mescolare bene la sospensione di virus e bagnare completamente il tappeto cellulare; in seguito la fiasca viene incubata per tre ore a 37°C e 5% di CO2. Al termine del periodo di incubazione attraverso una pipetta sterile viene rimosso e

scartato il volume inoculato. Si aggiunge alle cellule terreno di coltura fresco (12-14 ml per fiasche da 75 cm2 e 30-32 ml per fiasche da 150 cm2) e si ripone il tutto nuovamente all’interno dell’incubatore.

Giornalmente le cellule vengono osservate valutando l’effetto citopatico, il quale si manifesta in modo evidente in pochi giorni come distruzione completa del tappeto cellulare. Normalmente, alla m.o.i. indicata precedentemente, l’effetto citopatico è visibile dopo 2 giorni dall’infezione e risulta completo a 4-5 giorni. Per ottenere stock virali ad alto titolo infettivo, il virus viene raccolto dopo un periodo di tempo variabile da un minimo di tre ad un massimo di 5 giorni dopo l’infezione. La raccolta del virus avviene secondo le seguenti fasi:

 Dalle fiasche si rimuove completamente il terreno di coltura trasferendolo in una provetta da centrifuga

 La sospensione virale viene centrifugata a 433 rcf per 10 minuti allo scopo di chiarificare la preparazione purificandola dai detriti cellulari presenti.

 Il surnatante viene raccolto e filtrato utilizzando filtri da 0,2 µm 0,7 * TCID50/ml = PFU/ml

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 Il virus viene aliquotato in vial sterili e congelato a –80°C

Titolazione BVDV tramite saggio delle diluizioni limite su cellule MDBK

Per il test di titolazione, le cellule MDBK vengono tripsinizzate e contate attraverso la camera di Burker. Viene preparata una sospensione cellulare alla concentrazione di 105 cellule/ml, in modo da avere una quantità pari a 5*103 MDBK in 50 µl di sospensione. Per titolare un campione con titolo < 105 TCID50/ml è sufficiente un’intera piastra di titolazione da 96 pozzetti e quindi un

volume di cellule di 5 ml, mentre per campioni con titolo maggiore viene effettuata una prediluizione o vengono utilizzate più piastre di titolazioni successive. Tale procedimento è necessario perché il metodo di calcolo dell’infettività virale utilizza un metodo statistico applicabile quando si osserva una serie di titolazione completa che va dal 100% allo 0% dei pozzetti positivi.

Lo stock virale viene scongelato ed eventualmente diluito in terreno di coltura completo per cellule MDBK.

In ogni pozzetto della piastra di titolazione vengono inoculati 50 µl di terreno di coltura completo. Vengono aggiunti 25 µl del virus (eventualmente pre-diluito) in ognuno degli otto pozzetti della colonna 1. Si trasferiscono poi 25 µl della sospensione virale dalla colonna 1 alla colonna 2 e così via procedendo fino alla colonna 11 (e eventualmente anche in una piastra di titolazione successiva), in modo tale da effettuare una diluizione 1:3 da una colonna alla successiva. La colonna numero 12 rimane come controllo negativo del saggio ( controllo con solo cellule) e permette di valutare un’adeguata propagazione cellulare.

Infine vengono aggiunti 50 µl di cellule per pozzetto partendo dal controllo solo cellule (colonna 12) e proseguendo fino alla colonna 1 compresa. Si ripone la piastra in un incubatore al 5% di CO2

e 37°C fino al giorno dell’osservazione.

Dopo 6-7 giorni dall’infezione si va a valutare l’effetto citopatico, il quale si manifesta come progressiva distruzione del tappeto cellulare fino al completo distacco delle MBDK dal fondo del pozzetto. Vengono registrati i pozzetti positivi e negativi e si procede al calcolo dell’infettività virale tramite metodo di Spearmann-Karber. Questa formula statistica è applicabile quando si osserva una serie completa di titolazione ,cioè un range di titolazione che va dal 100% allo 0% di pozzetti positivi per diluizione di virus testata. Il metodo di Spearmann-Karber prevede l’utilizzo della seguente formula:

34 Deviazione standard

 Di è il logaritmo decimale dellaminore diluizione che risulta nel 100% dei pozzetti positivi,

nel caso in cui il campione venga titolato come tal quale, la diluizione 1, per cui Di=0

 p è la somma delle proporzioni di pozzetti positivi alle diverse diluizioni

 Fd è il logaritmo decimale del fattore di diluizione seriale

 [Di + (p-0,5) * Fd] corrisponde alla diluizione a cui ottengo il 50% dei pozzetti infettati

(unità logaritmiche)

La concentrazione di virus viene espressa come TCID50/ml o titolo virale T:

Dove:

 V è il volume di virus in ml aggiunto ad ogni replicato

Questo tipo di saggio non determina il numero assoluto di particelle virali contenute in un campione, ma fornisce solo una stima statistica della concentrazione a cui si avrebbe il 50% dei pozzetti positivi e il 50% dei pozzetti negativi (saggio quantale). L’accuratezza del saggio dipende dal numero di replicati effettuati per ogni diluizione; un maggior numero di replicati corrisponde ad una maggiore accuratezza. Risulta quindi importante indicare qual è l’errore statistico associato al titolo virale calcolato come sopra indicato; tale errore (espresso in unità logaritmiche) viene definito in base alla deviazione standard calcolata con la seguente formula:

Dove:

 n è il numero di pozzetti testati per ciascuna diluizione

 p è la proporzione dei pozzetti positivi testati a ciascuna diluizione

l’intervallo di confidenza per il titolo al 95% di probabilità viene espresso come  2 * deviazione standard