Metodica RealStar di Altona - Analisi attraverso diversi strumenti di amplificazione

Analisi attraverso diversi strumenti di amplificazione

4.2.1 Metodica RealStar di Altona

In questa ultima fase è stata provata la metodica Real Star di Altona, che da letteratura si presenta efficiente e molto sensibile. Questa metodica prevede come kit di estrazione il Viral, possiede un suo controllo interno e da manuale indica la possibilità di utilizzare diversi strumenti per amplificazione tra cui Rotorgene 6000 e ABIPrism 7900 HT SDS.

Nella prima prova è stata valuta l’efficienza del kit di amplificazione mediante l’utilizzo dello strumento ABIPrism 7900 HT SDS.

I campioni di HEV sono stati estratti seguendo il protocollo del kit Viral (raccomandato nelle istruzioni del kit di amplificazione), indicato nel paragrafo 3.3.4, partendo da 140 µl e sono:

 250 UI/ml in triplicato  25 UI/ml in triplicato  2,5 UI/ml in triplicato

Sono stati estratti anche i seguenti controlli:  K+, costituito da 2500 UI/ml  K-, costituito da plasma

 K+ kit, controllo fornito dal kit

In tutti i replicati è stato effettuato lo spiking, secondo protocollo, del controllo interno fornito insieme al kit di amplificazione, il quale è marcato con il fluoroforo JOE. L’eluizione è avvenuta in 30 µl. La mix di amplificazione è stata preparata seguendo il protocollo del kit Real Star di Altona, indicata nel paragrafo 3.3.6. La mix di amplificazione è così formata:

Mix di amplificazione

Reagenti Concentrazione

Master mix A Altona 5 µl Master mix B Altona 20 µl

Volume finale di reazione 50 µl: 25 µl di mix + 25 µl di RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (25 µl H2O + 25 µl mix, indicato

113

L’amplificazione è avvenuta su ABIPrism 7900 HT SDS alle condizioni di cicli e temperatura indicate sotto (i cicli utilizzati seguono le indicazioni fornite dal kit):

Come fluorescenza è stata selezionata FAM-BHQ per HEV e JOE-BHQ per IC di Altona

Risultati: Campioni Ct HEV 250UI/ml 34,91 HEV 250 UI/ml 33,42 HEV 250 UI/ml 34,39 HEV 25 UI/ml 38,74 HEV 25 UI/ml 37,35 HEV 25 UI/ml 35,85 HEV 2,5 UI/ml Undetermined HEV 2,5 UI/ml Undetermined HEV 2,5 UI/ml Undetermined

K+ 31,00

K- estr. Undetermined

K+ KIT 30,13

K- ampl. Undetermined FAM-BHQ per HEV

114 Campioni Ct HEV 250UI/ml 28,57 HEV 250 UI/ml 30,32 HEV 250 UI/ml 30,82 HEV 25 UI/ml 29,79 HEV 25 UI/ml 28,80 HEV 25 UI/ml 29,85 HEV 2,5 UI/ml 27,97 HEV 2,5 UI/ml 28,69 HEV 2,5 UI/ml 29,56 K+ 29,98 K- estr. 26,98 K+ KIT 28,61 K- ampl. Undetermined

In confronto al metodo sviluppato in house, si osserva un leggero miglioramento per quanto riguarda il segnale per HEV, ma ancor di più possiamo osservare un miglioramento per quanto riguarda il segnale del controllo interno.

Dal momento che da manuale viene indicato anche il Rotorgene 6000 come strumento per amplificazione, è stato valutato se il suo utilizzo per la fase di amplificazione permettesse un miglioramento nelle performance della metodica.

I campioni di HEV estratti seguendo il protocollo del kit Viral (raccomandato nelle istruzioni del kit di amplificazione), indicato nel paragrafo 3.3.4, partendo da 140 µl, sono:

 125 UI/ml in triplicato Come controllo è stato estratto:

 K-estr., costituito da plasma negativo

115

Mix di amplificazione

Reagenti Concentrazione

Master mix A Altona 5 µl Master mix B Altona 20 µl

Volume finale di reazione 50 µl: 25 µl di mix + 25 µl di RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (25 µl H2O + 25 µl mix, indicato

come K- ampl.).

L’amplificazione è avvenuta su Rotorgene 6000 alle condizioni di cicli e temperatura indicate sotto:

Come fluorescenza è stata selezionata FAM-BHQ per HEV e JOE-BHQ per IC di Altona

Risultati: Campioni Ct HEV 125 UI/ml 30,29 HEV 125 UI/ml 32,43 HEV 125 UI/ml 31,76 K+ kit 26,72 K- estr. Undetermined K- ampl. Undetermined

116 Campioni Ct HEV 125 UI/ml 29,64 HEV 125 UI/ml 29,97 HEV 125 UI/ml 29,38 K+ kit undetermined K- estr. 29,39 K- ampl. Undetermined JOE-BHQ per IC Segnale FAM-BHQ Segnale JOE-BHQ

117

Dai risultati si può constatare che tale metodica è effettivamente efficiente per la rilevazione di HEV e risulta promettente rispetto a tutte le metodiche precedentemente provate, sia valutando il segnale in uscita per i campione di HEV, sia valutando il segnale per il controllo interno.

Si è proseguito con l’indagine sull’end-point del metodo. A tale scopo sono state estratte concentrazioni decrescenti di HEV in tre prove differenti. Tutti i campioni, di ciascuna prova, sono stati estratti mediante il protocollo del kit Viral, indicato nel paragrafo 3.3.4, partendo da un volume di campione di 140l, alle seguenti concentrazioni ottenute da diluizioni di HEV-IS:

 HEV 125 UI/ml  HEV 62 UI/ml  HEV 31 UI/ml  HEV 15 UI/ml È stato estratto anche:

 K-, controllo negativo, costituito da plasma negativo.

In ogni campioni è stato aggiunto il controllo interno fornito dal kit Altona, secondo le

concentrazioni indicate nel protocollo al paragrafo 3.3.6.1. L’eluizione è avvenuta in 30 µl. La mix di amplificazione è stata preparata seguendo il protocollo di Altona, indicato nel protocollo 3.3.6.1. La mix di amplificazione era così formata:

Mix di amplificazione

Reagenti Concentrazione

Master mix A Altona 5 µl Master mix B Altona 20 µl

Volume finale di reazione 50 µl: 25 µl di mix + 25 µl di RNA estratto. L’amplificazione è avvenuta su Rotorgene 6000, alle condizioni di cicli e temperatura sotto riportate:

118 Risultati:

Campioni Ct Ct Ct

HEV 125 UI/ml 32,33 33,79 34,24

HEV 62 UI/ml 31,91 Undetermined 32,71

HEV 31 UI/ml 32,67 33,0 Undetermined

HEV 15 UI/ml Undetermined Undetermined 33,85 K- Undetermined Undetermined Undetermined K –ampl. Undetermined Undetermined Undetermined

Campioni Ct Ct Ct HEV 125 UI/ml 32,67 28,21 27,92 HEV 62 UI/ml 30,56 27,45 27,59 HEV 31 UI/ml 31,34 27,13 27,01 HEV 15 UI/ml 32,11 27,53 27,77 K- 31,63 27,40 27,95

K- ampl. Undetermined Undetermined Undetermined

Dai risultati ottenuti, analizzando la rilevazione del segnale per HEV e considerando che l’end point viene calcolato in modo statistico sul 95% dei campioni, in una prima analisi si può presupporre che l’end point del metodo sia compreso tra 31UI/ml e 62 UI/ml. In base ai dati ottenuti in queste prove, per la semplicità dell’analisi e per i dati a supporto della validazione forniti dal produttore, è stato scelto quest’ultimo metodo pe proseguire con la validazione della metodica da inserire come controllo nel processo produttivo del plasma trattato S/D.

4.3 Validazione

Il metodo NAT scelto per la rilevazione di HEV-RNA in pool di plasma prevede estrazione seguendo il protocollo del kit Viral e amplificazione con il kit Real Star di Altona. Di seguito sono riportate le prove fatte per la validazione del metodo NAT qualitativo scelto secondo quanto indicato da Farmacopea Europea e dalla linea guida ICH Q2B.

FAM-BHQ per HEV

119

Detection limit

Le prove eseguite per determinate il detection limit della metodica sono state fatte estraendo sei campioni di HEV ottenuto da diluizioni dello standard HEV-IS, a concentrazione nota, in quattro giorni diversi. I dati ottenuti sono stati riportati in tabella.

Prove IU/ml Run 1 2 3 4 5 6 Totali Positive % detection

120

I Run Pos Pos Pos Pos Pos Pos

24 24 100 2 II Run Pos Pos Pos Pos Pos Pos

3 III Run Pos Pos Pos Pos Pos Pos 4 IV Run Pos Pos Pos Pos Pos Pos 5

I Run Pos Pos Pos Pos Pos Pos

24 22 92 6 II Run Pos Pos Pos Neg Pos Pos

7 III Run Pos Pos Pos Pos Neg Pos 8 IV Run Pos Pos Pos Pos Pos Pos 9

I Run Pos Pos Pos Pos Neg Pos

24 22 92 10 II Run Pos Pos Pos Pos Pos Pos

11 III Run Neg Pos Pos Pos Pos Pos 12 IV Run Pos Pos Pos Pos Pos Pos 13

I Run Pos Neg Neg Pos Pos Neg

24 17 71 14 II Run Pos Pos Neg Pos Pos Pos

15 III Run Pos Neg Neg Pos Pos Pos 16 IV Run Pos Pos Pos Pos Pos Neg

7,5

I Run Neg Pos Pos Pos Pos Pos

24 12 50 18 II Run Neg Pos Pos Neg Neg Neg

19 III Run Neg Neg Pos Pos Neg Neg

20 IV Run Neg Pos Neg Pos Pos Neg

3,8

I Run Neg Neg Neg Neg Neg Neg

24 3 13 22 II Run Neg Neg Neg Neg Pos Neg

23 III Run Neg Neg Neg Neg Neg Neg

120 Riassumendo i dati:

Concentrazione standard Camp positivi/tot campioni

120 UI/ml 24/24 60 UI/ml 22/24 30 UI/ml 22/24 15 UI/ml 17/24 7.5 UI/ml 12/24 3.8 UI/ml 3/24

Attraverso il calcolo del probit, calcolato sui dati della precedente tabella sono stati ottenuti i seguenti risultati:

Limit of detection determined with the 1st International Standard for HEV RNA for nucleic acid Amplification Technology Assays (PEI code 6329/10)

minimo media massimo

ED 95/ml 7720,9 5156,88 2596,43

IU/ml 32,4 48,5 96,3

Probit 95 % Hit rate 48,5 IU/ml 95% confidence range: 32,4 ÷ 96,3 IU/ml

Robustezza

Le prove sulla robustezza del metodo sono state eseguite su 20 campioni. La concentrazione testata risulta tre volte al cut off. Di seguito sono riportati i risultati ottenuti:

121

Tabella A Robustezza HEV

Campione Concentrazione HEV Risultato HEV

1 145.5 UI/ml Pos 2 145.5 UI/ml Pos 3 145.5 UI/ml Pos 4 145.5 UI/ml Pos 5 145.5 UI/ml Pos 6 145.5 UI/ml Pos 7 145.5 UI/ml Pos 8 145.5 UI/ml Pos 9 145.5 UI/ml Pos 10 145.5 UI/ml Pos 11 145.5 UI/ml Pos 12 145.5 UI/ml Pos 13 145.5 UI/ml Pos 14 145.5 UI/ml Pos 15 145.5 UI/ml Pos 16 145.5 UI/ml Pos 17 145.5 UI/ml Pos 18 145.5 UI/ml Pos 19 145.5 UI/ml Pos 20 145.5 UI/ml Pos

Sempre per valutare la robustezza del metodo è stata testata anche la cross-contaminazione, testando in una stessa piastra campioni positivi e negativi alternati nei vari pozzetti. Di seguito sono riportati i risultati ottenuti:

122

Tabella B Robustezza B HEV

Poiché tutti i campioni indicati nella tabella A sono positivi e poiché non avviene cross- contaminazione, come indicato nella tabella B, si può affermare che il metodo è robusto.

Specificità

Per quanto riguarda i test da effettuare per valutare la specificità dei primer di HEV rispetto ad altri virus, quanto indicato dal fornitore (indicato in paragrafo 3.4) può essere considerato accettabile e non sono stati effettuati test aggiuntivi. Per quanto riguarda invece i pool negativi da testare con due metodiche differenti, al momento con la metodica NAT qualitativa scelta ne sono stati testati 100. Gli stessi saranno testati in un laboratorio esterno per la conferma dei dati in accordo a quanto richiesto da Farmacopea.

N° campione Sample ID Campione Risultato atteso Risultato N° campione Sample ID Campione Risultato atteso Risultato

Nel documento Sviluppo metodica NAT per la rilevazione di HEV RNA in pool di plasma (pagine 112-122)