Messa a punto della fase di amplificazione ed estrazione di HEV senza l’aggiunta di IC

In questa fase è stata valutata e ottimizzata l’estrazione/amplificazione di campioni contenenti diverse concentrazioni di HEV, senza l’aggiunta di controllo interno a partire dalla fase di estrazione.

Inizialmente è stato valutato il set di primer/probe migliore per la rilevazione del segnale di HEV. Per tale motivo è stata realizzata l’estrazione di diversi campioni di HEV, costituiti da preparazioni qualificate da laboratori di Organismi di Controllo Internazionali (PEI e WHO):

 HEV #86 (1*104 copie/ml)  HEV S1 (2,5*105 UI/ml)  HEV IS (2,5*104 UI/ml)

53 È stato estratto anche:

 K- estr., controllo negativo, ossia plasma precedentemente testato e risultato negativo per HEV

L’estrazione è stata eseguita seguendo il protocollo di MinElute®

(protocollo indicato nel paragrafo 3.3.4), utilizzando 200 µl di campione di partenza e eluendo in 60 µl. Sono state preparate 2 mix di amplificazione, diversificate nel set di primer/probe per HEV usati: il set 1 era costituito da primer/probe disegnati sulla ORF2/3, il set 2 da primer/probe disegnati sulla ORF2 (sequenze indicate nel paragrafo 3.3.3). Le due mix di amplificazione erano quindi costituite entrambe dai reagenti della MMX BioSC alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5 e ciascuna dal rispettivo set primer/probe, alle concentrazioni indicate sotto:

Mix 1 (set 1)

Primer/probe HEV Concentrazione finale

Primer-F [0,2µM]

Primer-R [0,2µM]

Probe [0,3µM]

Mix 2 (set 2)

Primer/probe HEV Concentrazione finale

Primer-F [0,2µM]

Primer-R [0,2µM]

Probe [0,3µM]

Volume di reazione finale 50 µl: 30 µl mix + 20 µl RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (20 µl H2O + 30 µl mix, indicato come K-

ampl.). L’amplificazione è stata effettuata su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con condizioni di cicli e temperatura indicate sotto:

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Come fluorescenza è stata selezionata FAM-BHQ per selezionare il probe del set 1 e HEX-BHQ per selezionare il probe del set 2

Risultati:

Campione Ct SET 1 Ct SET 2

HEV #86 23,41 44,93

S1 31,14 36,98

IS 34,86 Undetermined

K- estr. Undetermined Undetermined K- ampl. Undetermined Undetermined

Dai risultati ottenuti si evince che il set 1, disegnato sulla ORF2/3 di HEV, risulta più efficiente del set 2, inoltre, in base allo studio di Jothikumar (Jothikumar 2006), per questo set di primer si

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hanno anche indicazioni di mancanza di cross reattività con altri virus enterici. Per tale motivo nelle prove effettuate in seguito è stato scelto di utilizzare il set 1.

In seguito è stata identificata la concentrazione ottimale primer/probe per HEV nella mix di amplificazione. A tal scopo sono stati estratti dieci campioni di HEV-S1, diluito in soluzione fisiologica 1:10, con concentrazione finale di 2,5*104 UI/ml. L’estrazione è stata eseguita seguendo il protocollo del kit MinElute® (protocollo indicato nel paragrafo 3.3.4), che prevede 200 µl di campione di partenza e eluizione in 60 µl; è stato fatto poi un pool unico degli eluati per ridurre la variabilità tra i campioni, dovuta alla fase di estrazione. Nella mix di amplificazione è stato aggiunto anche DMSO come agente denaturante (concentrazione finale 212 mM). I reagenti comuni a tutte le mix erano quelli della MMX BioSC, alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5, il DMSO e il probe, alle quali sono stati aggiunti i primer per HEV in modo da ottenere diverse concentrazioni.

Le sedici diverse combinazioni e concentrazioni di primer F/ R analizzate sono le seguenti:

Combinazione Concentrazione finale

1 F= 0,1µM R= 0,1µM 2 F= 0,1µM R= 0,2µM 3 F= 0,1µM R= 0,4µM 4 F= 0,1µM R= 0,6µM 5 F= 0,2µM R= 0,1µM 6 F= 0,2µM R= 0,2µM 7 F= 0,2µM R= 0,4µM 8 F= 0,2µM R= 0,6µM 9 F= 0,4µM R= 0,1µM 10 F= 0,4µM R= 0,2µM 11 F= 0,4µM R= 0,4µM 12 F= 0,4µM R= 0,6µM 13 F= 0,6µM R= 0,1µM 14 F= 0,6µM R= 0,2µM 15 F= 0,6µM R= 0,4µM 16 F= 0,6µM R= 0,6µM

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Volume di reazione finale 50 µl: 30 µl mix + 20 µl RNA estratto. L’amplificazione è stata effettuata su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con condizioni di cicli e temperatura indicate sotto:

Come fluorescenza è stata selezionata FAM-BHQ. Risultati: Combinazione Ct 1 36,71 2 34,20 3 33,51 4 33,23 5 35,97 6 35,55 7 34,36 8 30,83 9 36,46 10 34,42 11 34,08 12 34,09 13 36,44 14 35,06 15 34,14 16 33,14

Dai risultati si desume che la mix più efficiente è quella rappresentata dalla combinazione 8, con concentrazioni finali di primer F= 0,2µM e di primer R= 0,6µM. Paragonando inoltre i risultati

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ottenuti nella prova precedente con la combinazione 6 che rappresenta concentrazioni di primer /probe analoghi, non si osservano significative differenze per il campione 104 UI/ml, per cui sembra che la presenza di DMSO non modifichi significativamente le performance della reazione. Successivamente, è stato valutato se la fase di RT separata dall’amplificazione potesse migliorare i risultati raggiunti e permettere rilevazione del segnale anche a concentrazioni più basse di HEV. Per questo motivo alcuni campioni estratti sono stati sottoposti sia a RT-PCR one step che ad amplificazione effettuando la fase di RT separata da PCR. Attraverso il protocollo del kit MinElute®(come indicato in paragrafo 3.3.4), che prevede 200 µl di campione di partenza, sono stati estratti campioni costituiti dalle seguenti concentrazioni di HEV-IS (diluizioni effettuate con plasma negativo):

 2,5*104 UI/ml  2,5*103 UI/ml  316,2 UI/ml

L’eluizione è avvenuta in 60 µl.

Per 1 replicato di ciascun campione è stata preparata la mix per effettuare la Reverse Trascription (RT) separatamente dall’amplificazione:

¬ 10 µl HEV primer R + 5 µl dNTPs: questa è stata aliquotata, 3 µl per campione ¬ Aggiunti 10 µl di RNA estratto

¬ È stata effettuata poi una fase di incubazione a 65°C per 5 minuti, seguita da 1 minuto in ghiaccio per svolgere eventuali strutture secondarie.

Ai 13 µl sono stati aggiunti 7µl di mix preparati nel seguente modo:

MIX

Buffer (5X) RT 20 µl DTT 0,1M 5 µl RNase OUT 5 µl RT Sup III 5 µl

Il tutto è stato incubato a 50°C per 45 minuti per far avvenire la RT; è seguita poi una fase a 70°C per 15 minuti per permettere l’inattivazione dell’enzima, al termine la miscela di cDNA è stata diluita 1:5 e di questa diluizione sono stati amplificati 20 µl e 10 µl per ciascun campione.

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Per la one step sono stati amplificati 20 µl di RNA estratto. Per paragonare l’efficienza di RT separata e non, sono state preparate due mix PCR: quella per la RT-PCR one step è stata preparata con i reagenti della MMX BioSC, alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5, con l’aggiunta dei primer F/R e probe per HEV, mentre la mix di amplificazione per i campioni in cui la RT è stata fatta separatamente è priva dell’enzima RT Sup III che permette la trascrizione inversa.

Mix di Amplificazione per RT one-step

Reagente Concentrazione

Primer F [0,2µM]

Primer R [0,6µM]

Probe [0,3µM]

Mix di Amplificazione per RT separata

Reagente Concentrazione MgCl2 [3mM] TA [1X] dNTP’s [0,8mM] Primer F [0,2µM] Primer R [0,2µM] Probe [0,3µM]

AmpliTaq Gold [0,025 U/µl]

Per ciascun campione il volume di reazione finale è stato 50 µl, costituito da: 30 µl di mix+ 20 µl RNA estratto (o 20 µl di cDNA diluito 1:5 o 10 µl di cDNA diluito 1:5+10 µl di H2O)

In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (20 µl H2O

+ 30 µl mix, indicato come K- ampl.).

L’amplificazione è stata eseguita su ABIPrism 7900 HT SDS, con condizioni di cicli e temperatura indicate sotto:

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Come fluorescenza è stata selezionata FAM/BHQ per visualizzare il segnale di HEV. Risultati:

Campione Campioni cDNA Campioni RT one step

Ct (4 µl) Ct (2 µl) Ct (20 µl)

HEV 2,5*104 UI/ml 36,02 38,02 34,44

HEV 2,5*103 UI/ml 41,03 Undetermined 41,04

HEV 316,2 UI/ml Undetermined Undetermined Undetermined

K- ampl. Undetermined Undetermined Undetermined

Dai risultati si può constatare che la sensibilità ottenuta con RT separata non risulta migliorativa rispetto alla one step, mentre a livello di praticità, la RT one step risulta più semplice nell’esecuzione per cui si è deciso di procedere utilizzando sempre la one step.

Sono state poi effettuare modificazioni nella fase di estrazione per migliorare la rilevazione del segnale di HEV. E’ stato valutato se l’eluizione in minor volume (vale a dire 35 µl anziché 60 µl, per concentrare gli acidi nucleici), e il cambiamento di volume finale della mix di reazione (75 µl anziché 50 µl, per permettere di amplificare una quantità maggiore di RNA estratto). I campioni sono stati estratti in duplicato seguendo il protocollo del kit MinElute® , indicato nel paragrafo 3.3.4, che prevede 200 µl di campione di partenza. I campioni estratti sono stati ottenuti dall’HEV-IS, diluendo con plasma negativo fino ad ottenere le seguenti concentrazioni:

 2,5*104UI/ml  7,9*102UI/ml  2,5*102 UI/ml  100 UI/ml

I campioni sono stati eluiti in 35 µl. La mix di amplificazione era costituita dai reagenti della MMX BioSC alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5, con l’aggiunta dei primer per HEV alle concentrazioni finali riportate in tabella:

Mix di Amplificazione

Reagente Concentrazione

Primer F [0,2µM]

Primer R [0,6µM]

Probe [0,3µM]

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Volume di reazione finale 75 µl: 45 µl di mix + 30 µl RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (30 µl H2O + 45 µl mix, indicato

come K- ampl).

L’amplificazione è avvenuta su ABIPrism 7900 HT SDS, con condizioni di cicli e temperatura indicate sotto.

Come fluorescenza è stata selezionata FAM/BHQ per visualizzare il segnale di HEV. Risultati: Campioni Ct HEV 2,5*104 UI/ml 31,77 HEV 2,5*104 UI/ml 32,42 HEV 7,9*102 UI/ml 35,04 HEV 7,9*102 UI/ml 35,79 HEV 2,5*102UI/ml 41,98 HEV 2,5*102UI/ml 43,40 HEV 100 UI/ml 41,27 HEV 100 UI/ml 46,89 K- ampl. Undetermined

Dai valori ottenuti, l’eluizione in 35 µl e il nuovo volume di reazione mostrano un aumento di sensibilità nella rilevazione di HEV poiché permettono la rilevazione anche di 100 UI/ml. La possibilità di utilizzare un volume di reazione maggiore permette inoltre un’eventuale utilizzo di altri strumenti di amplificazione, come il Cobas TaqMan 48, che prevede un volume minimo di reazione pari a 75 µl.

In seguito, è stato valutato se fosse possibile incrementare ulteriormente la sensibilità partendo da una maggiore quantità di campione da estrarre o cambiando i cicli di amplificazione. I campioni sono stati estratti tramite il kit MinElute®, partendo da 400 µl di campione e non da 200 µl, ed è

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stato eseguito doppio caricamento su colonna. Le diluizioni di HEV estratte in doppio, secondo questo protocollo sono state:

 316,2 UI/ml  250 UI/ml  100 UI/ml  25 UI/ml

L’eluizione è avvenuta in 35 µl

La mix di amplificazione era costituita dai seguenti reagenti alle concentrazioni finali molari note, portata a volume con H2O:

Mix di Amplificazione

Reagente Concentrazione

Primer F [0,2µM]

Primer R [0,6µM]

Probe [0,3µM]

Volume di reazione finale 75 µl: 45 µl di mix+ 30 µl RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (30 µl H2O + 45 µl mix, indicato

come K- ampl).

L’amplificazione è avvenuta su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con specifiche condizioni di cicli e temperatura:

62 Risultati: Campioni Ct 316,2 UI/ml 40,35 250 UI/ml 42,48 100 UI/ml 47,44 25 UI/ml Undetermined K- ampl. Undetermined

Partendo da 400 µl di campione e effettuando doppio caricamento, non si riesce comunque a visualizzare una concentrazione del virus inferiore a 100 UI/ml. Per tale motivo è stata scartata la possibilità di partire da un volume maggiore di campione.

Successivamente è stato valutato se, cambiando i cicli dell’amplificazione, ossia unendo la fase di annealing a quella di extension alla temperatura di 60°C per 45 secondi, era possibile migliorare ulteriormente i risultati.

Con gli stessi campioni estratti in precedenza e con la mix preparata secondo le modalità utilizzate precedentemente, è stata effettuata amplificazione su ABIPrism 7900 HT SDS, con condizioni di cicli e temperatura sotto indicate:

Come fluorescenza è stata selezionata FAM/BHQ per visualizzare il segnale di HEV. FAM-BHQ per HEV

63 Risultati: Campioni Ct HEV 316,2 UI/ml 36,56 HEV 250 UI/ml 35,37 HEV 100 UI/ml 37,93 HEV 25 UI/ml 39,98

Dal momento che viene osservato anche il segnale per il campione contenente 25 UI/ml, si evince che il cambiamento dei cicli di amplificazione aumenta la sensibilità della metodica.

Alla fine di questa seconda fase sono state identificate le condizioni migliori di estrazione e amplificazione di HEV senza l’aggiunta di un controllo interno: estrazione partendo da 200 µl di campione, eluizione in 35 µl e amplificazione con nuovi cicli modificati, dove l’ultima fase (annealing + extension) avviene a 60 °C per 45 secondi.

4.1.3

Prove per identificare la quantità minima di controllo