Una volta appurate le condizioni migliori per la fase di amplificazione, si è passati all’analisi di diversi kit di estrazione per verificare la possibilità di aumentare la sensibilità del metodo. Fino a questo momento il kit utilizzato è stato il kit MinElute®, ma da indagini in letteratura, e come indicato nello studio collaborativo realizzato per ricercare lo standard internazionale per HEV, è stato possibile individuare altri kit di estrazione: il Viral RNA Mini Kit (richiesto specificatamente anche dal kit di amplificazione Real Star di Altona), il kit TNAI, che permette l’automatizzazione dell’estrazione, applicabile sullo strumento COBAS AmpliPrep (estrattore automatico) e il kit Ultransens®, il quale prevede un campione di partenza con un volume più elevato (1 ml) rispetto agli altri kit.
I campioni estratti con ciascun kit, sono sempre stati testati in triplicato, alle seguenti concentrazioni di HEV:
250 UI/ml 25 UI/ml 2,5 UI/ml
Sono stati estratti, in triplicato, anche i controlli: K+ (25000 UI/ml)
K- estr., plasma negativo
I protocolli di estrazione dei diversi kit investigati (Viral, Ultrasens® e TNAI) sono riportati nei paragrafi 3.3.4
Nei Buffer di lisi iniziali è stato aggiunto 1µl di IC (quantità in estrazione 1,66 Log TCID50) per
76
La mix di amplificazione era costituita dai reagenti della MMX BioSC alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5, con l’aggiunta dei relativi primer/probe per HEV e BVDV, alle concentrazioni finali riportare di seguito:
Mix BioSC Reagente Concentrazione Primer-F HEV [0,2µM] Primer-R HEV [0,6µM] Probe HEV [0,3µM] Primer-F BVDV [0,2µM] Primer-R BVDV [0,2µM] Probe BVDV [0,2µM]
Volume finale di reazione 75 µl era in tutti i casi:45 µl mix + 30 µl RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (30 µl H2O + 45 µl
mix, indicato come K- ampl). L’amplificazione è stata eseguita su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con condizioni di cicli e temperatura indicate sotto:
77 Risultati:
Campioni Ct Ultrasens Ct Viral Ct TNAI Ct MinElute
Media (dev.standard) Media (dev.standard) Media (dev.standard) Media (dev.standard)
HEV 250 UI/ml 35,58 (2,45) 34,37 (0,39) Undetermined 35,12 (0,68) HEV 25 UI/ml 41,70 (3,07) 38,00 (2,24) Undetermined* 38,05 (1,19) HEV 2,5 UI/ml Undetermined 39,56 (1,84) Undetermined Undetermined
K+estr Undetermined 31,13 Undetermined 32,57
K- estr. Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined K- ampl. Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined
Campioni Ct Ultrasens Ct Viral Ct TNAI Ct MinElute
Media (dev.standard) Media (dev.standard) Media (dev.standard) Media (dev.standard) HEV 250 UI/ml 36,92 (1,55) 32,73 (0,98) 35,27 (0,44) 35,68 (1,50) HEV 25 UI/ml 36,84 (0,36) 33,99 (0,24) 34,906 * 36,27 (1,30) HEV 2,5 UI/ml 43,14 (2,94)** 33,84 (0,38) 33,93 (0,43) 35,88 (0,44) K+estr. Undetermined 33,69 34,35 36,11 K- estr. 37,71 33,75 34,69 35,47
K- ampl. Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined **valore calcolato considerando per i replicati Undetermined un valore pari a 45, numero di cicli della reazione di amplificazione
*Due campioni, per TNAI, da 25 UI/ml sono stati scartati dalla macchina a causa di volumi errati/ gocce sulla provetta, e per tale motivo non è avvenuta l’estrazione
FAM-BHQ per HEV
80
Per il kit di estrazione MinElute®, sono stati considerati i valori ottenuti nell’esperimento dove erano confrontati diverse tipologie di primer/probe presenti in commercio. Per tale motivo si trovano nella tabella selezionati in giallo, con rispettive medie e deviazioni standard.
Dai risultati ottenuti, sia per la qualità di rilevazione di HEV che del controllo interno, è stato constatato che il kit automatizzato TNAI non dà risultati soddisfacenti nella rilevazione di HEV, mentre il kit di estrazione Ultrasens® a paragone di MinElute® e Viral risulta peggiore. Sia MinElute® che Viral danno buoni risultati; il kit Viral sembra poter rilevare anche 2,5 UI/ml. Dal momento che il kit Viral nell’esperimento precedente ha permesso la rilevazione del segnale anche a 2,5 UI/ml, è stata allestita una nuova estrazione per confermare i risultati precedentemente ottenuti. Il kit è stato testato nuovamente per le concentrazioni valutate in precedenza, sempre in triplice copia, ma partendo da minor volume di campione, pari a 140 µl (nella prova precedente era stato utilizzato un campione di 280 µl).
Come controlli sono stati estratti: K+ (2500 UI/ml)
K- estr., plasma negativo
Nel Buffer AVL+ RNA carrier è stato spikato 1 µl di IC (1,66 log TCID50 in estrazione) per
campione. L’eluizione è avvenuta in 35 µl. La mix di amplificazione era costituita dai reagenti alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5, con l’aggiunta dei primer/probe sia per HEV sia per BVDV:
Volume finale di reazione 75µl: 45 µl mix + 30 µl RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (30 µl H2O + 40 µl mix, indicato come K-
ampl.). L’amplificazione è stata eseguita su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con condizioni di cicli e temperatura indicate sotto:
Mix BioSC
Reagente Concentrazione finali
Primer-F HEV [0,2µM] Primer-R HEV [0,6µM] Probe HEV [0,3µM] Primer-F BVDV [0,2µM] Primer-R BVDV [0,2µM] Probe BVDV [0,2µM]
81
Come fluorescenza è stata selezionata FAM-BHQ per HEV e HEX-BHQ per BVDV
Risultati: Campione Ct HEV 250 UI/ml 36,99 HEV 250 UI/ml 36,40 HEV 250 UI/ml 37,30 HEV 25 UI/ml 38,01 HEV 25 UI/ml 41,97 HEV 25 UI/ml 43,67 HEV 2,5 UI/ml 39,19 HEV 2,5 UI/ml 40,04 HEV 2,5 UI/ml 39,08 K+(2500UI/ml) 34,16 K- estr. 40,14 K-ampl. Undetermined
82 Campione Ct HEV 250 UI/ml 33,12 HEV 250 UI/ml 33,82 HEV 250 UI/ml 33,75 HEV 25 UI/ml 32,85 HEV 25 UI/ml 34,75 HEV 25 UI/ml 33,99 HEV 2,5 UI/ml 35,00 HEV 2,5 UI/ml 34,65 HEV 2,5 UI/ml 33,27 K+(2500UI/ml) 33,11 K- estr. 34,52 K- ampl. Undetermined
Dai risultati si osservano nuovamente risultati positivi per quanto riguarda l’HEV alla concentrazione di 2,5 UI/ml. In questo esperimento risulta però positivo il controllo negativo di estrazione.
È stata allestita una nuova estrazione per testare il kit Viral, che al momento sembrava più sensibile, per basse concentrazioni di HEV al fine di valutare fin dove potesse avvenire la rilevazione del virus nel plasma, inoltre la positività del controllo negativo di estrazione era indice di una possibile contaminazione e poneva dubbi sull’affidabilità dei risultati positivi (specialmente per i campioni a basso titolo). I campioni sono stati estratti in triplicato, con il kit Viral, partendo da 140 µl di campione e seguendo il protocollo, indicato nel paragrafo 3.3.4. Le concentrazioni di HEV testate sono state le seguenti:
20 UI/ml 5 UI/ml 1,25 UI/ml
Come controlli sono stati estratti: K+ (250 UI/ml)
K- estr., plasma negativo
83
Nel Buffer AVL+ RNA carrier è stato spikato 1 µl di IC (1,66 log TCID50 in estrazione) per
campione. L’eluizione è stata eseguita in 35 µl.
La mix di amplificazione era costituita dai reagenti della MMX BioSC alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5., con l’aggiunta dei primer/probe per HEV e BVDV:
Mix BioSC Reagente Concentrazione Primer-F HEV [0,2µM] Primer-R HEV [0,6µM] Probe HEV [0,3µM] Primer-F BVDV [0,2µM] Primer-R BVDV [0,2µM] Probe BVDV [0,2µM]
Volume finale di reazione 75µl, in entrambi i casi: 45 µl mix + 30 µl RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (30 µl H2O + 45 µl
mix, indicato come K- ampl). L’amplificazione è stata eseguita su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con condizioni di cicli e temperatura sotto indicate:
84 Risultati: Campione Ct HEV 20 UI/ml 38,91 HEV 20 UI/ml 38,70 HEV 20 UI/ml 36,41 HEV 5 UI/ml 43,49 HEV 5 UI/ml 42,00 HEV 5 UI/ml 39,44 HEV 1,25 UI/ml 40,64 HEV 1,25 UI/ml 43,13 HEV 1,25 UI/ml 43,55 K+ 39,41 K- estr. 42,32 K- ampl. Undetermined Campione Ct HEV 20 UI/ml 32,68 HEV 20 UI/ml 33,95 HEV 20 UI/ml 34,13 HEV 5 UI/ml 34,58 HEV 5 UI/ml 34,27 HEV 5 UI/ml 34,43 HEV 1,25 UI/ml 34,95 HEV 1,25 UI/ml 35,01 HEV 1,25 UI/ml 34,66 K+ 34,56 K- estr. 34,24 K- ampl. Undetermined FAM-BHQ per HEV
85
La positività del controllo negativo di estrazione anche in questo secondo esperimento, fa notare un problema fino a questo momento non evidenziato. Questa positività potrebbe essere dovuta a:
a) una contaminazione del controllo negativo (conservato fino a questo momento in aliquote non monouso)
b) Ad una non reale negatività del controllo negativo a HEV c) Ad una sovrapposizione di fluorescenze
a) Prova a favore della non contaminazione del plasma
Allo scopo di valutare se il plasma utilizzato fino a questo momento, sia per effettuare diluizioni sia come controllo negativo, fosse stato contaminato, è stata eseguita estrazione di diversi campioni di HEV a diluizioni note e un controllo negativo costituito dal plasma eventualmente contaminato, in cui è stato aggiunto il controllo interno; parallelamente è stato estratto un ulteriore campione di plasma, eventualmente contaminato, e un controllo positivo, costituito da HEV alla concentrazione di 2500 UI/ml, dove non è stato spikato il controllo interno. Se il plasma risulta essere contaminato, otterremo valori in uscita per HEV in entrambi i controlli interni negativi. I campioni sono stati estratti mediante il kit Viral, partendo da 140 µl di campione e seguendo il protocollo. Le concentrazioni dei campioni di HEV, estratti in doppio senza aggiunta di IC, sono:
20 UI/ml 5 UI/ml 1,25 UI/ml
Sono stati estratti in singolo anche:
K- (plasma negativo) in cui è stato spikato il controllo interno K- (plasma negativo) in cui non è stato spikato il controllo interno K+ (2500 UI/ml HEV) in cui non è stato spikato il controllo interno
L’eluizione è avvenuta per tutti i campioni in 35 µl. La mix di amplificazione era costituita dai reagenti della MMX BioSC, alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5, con l’aggiunta dei primer/probe di HEV e BVDV:
86 Mix BioSC Reagente Concentrazione Primer-F HEV [0,2µM] Primer-R HEV [0,6µM] Probe HEV [0,3µM] Primer-F BVDV [0,2µM] Primer-R BVDV [0,2µM] Probe BVDV [0,2µM]
Volume finale di reazione 75µl , in entrambi i casi: 45 µl mix + 30 µl RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (30 µl H2O + 45 µl
mix, indicato come K- ampl.).L’amplificazione è stata eseguita su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con condizioni di cicli e temperatura sotto riportate:
Come fluorescenza sono state selezionate FAM-BHQ e HEX-BHQ per la visualizzazione di HEV e BVDV rispettivamente.
Risultati:
Campione Ct
HEV 20 UI/ml 40,12
HEV 20 UI/ml Undetermined
HEV 5 UI/ml 41,49
HEV 5 UI/ml Undetermined HEV 1,25 UI/ml Undetermined HEV 1,25 UI/ml Undetermined
K+ 33,93
K- senza IC Undetermined
K- con IC 35,81
87
Campione Ct
HEV 20 UI/ml Undetermined HEV 20 UI/ml Undetermined HEV 5 UI/ml Undetermined HEV 5 UI/ml Undetermined HEV 1,25 UI/ml Undetermined HEV 1,25 UI/ml Undetermined
K+ Undetermined
K- estr senza IC Undetermined K- estr. con IC 33,99
K- ampl. Undetermined
La positività del K- in concomitanza alla presenza del controllo interno, fa pensare ad una sovrapposizione della fluorescenza piuttosto che ad una contaminazione del plasma, inoltre anche i campioni a più basso titolo di HEV risultano negativi, diversamente da quanto osservato nella prova precedente in cui era stato aggiunto anche il IC.
b) Prova ulteriore della negatività del controllo a HEV
Dal momento che non è stato trovato in commercio un campione di plasma certificato negativo per HEV, non è possibile avere la sicurezza al 100% di un controllo negativo per HEV. Per tale motivo, è stato allestito un nuovo esperimento dove sono stati testate diversi lotti di plasma, compreso quello testato fino a questo momento.
Attraverso il kit Viral, che prevede 140 µl di partenza, indicato nel paragrafo 3.3.4, sono stati estratti tre campioni di plasma presunti negativi di diversa origine, tra cui il plasma utilizzato in tutti le prove precedenti, denominato con P2:
P 1, estratto in doppio P 2, estratto in quadruplo P 3, estratto in doppio
K- ampl. Undetermined
88 Il controllo negativo di estrazione:
K- estr., costituito da H2O
Sono stati preparati due Buffer AVL+ RNA carrier, in uno dei quali è stato effettuato lo spiking del controllo interno, 1 µl per campione (1,66 Log TCID50) ed stato utilizzato per estrarre due
campioni del plasma denominato P2. Tutti gli altri campioni sono stati testati senza l’aggiunta di IC. L’eluizione è avvenuta per tutti i campioni in 35 µl.
La mix di amplificazione era costituita dai reagenti della MMX BioSC, alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5:
Mix BioSC Reagente Concentrazione Primer-F HEV [0,2µM] Primer-R HEV [0,6µM] Probe HEV [0,3µM] Primer-F BVDV [0,2µM] Primer-R BVDV [0,2µM] Probe BVDV [0,2µM]
Volume finale di reazione 75µl , in entrambi i casi: 45 µl mix + 30 µl RNA estratto. L’amplificazione è stata eseguita su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con condizioni di cicli e temperatura sotto indicate:
Come fluorescenza sono state selezionate FAM-BHQ e HEX-BHQ per la visualizzazione di HEV e BVDV rispettivamente.
89 Risultati: Campione Ct P1 a Undetermined P1 b Undetermined P2 a Undetermined P2 b Undetermined P3 a Undetermined P3 b Undetermined P2 a + IC Undetermined P2 b + IC 40,84 K- estr. Undetermined Campione Ct P1 a Undetermined P1 b Undetermined P2 a Undetermined P2 b Undetermined P3 a Undetermined P3 b Undetermined P2 a+IC 40,83 P2 b + IC 33,60 K- estr. Undetermined
Questa prova è a sostegno della non contaminazione del plasma, ma piuttosto della sovrapposizione del segnale di FAM e HEX, fluorofori utilizzati per le due diverse sonde, poiché si ha positività del controllo interno nei campioni dove viene effettuato lo spiking del controllo
FAM/BHQ per HEV
90
interno. Il fatto che un campione P2 + IC non risulti positivo a HEV, anche se è stato inserito il controllo interno, può essere dovuto a una minor quantità del controllo interno nella miscela di reazione, come confermato dal Ct di uscita superiore all’atteso per tale campione.
In conclusione il plasma rimane comunque presunto negativo a HEV, o comunque ad un titolo talmente basso che non è stato possibile rilevarlo durante la messa a punto della metodica.
c) Prova a favore della sovrapposizione delle fluorescenze
Una volta stabilito che il problema era probabilmente dato dalla sovrapposizione delle fluorescenze, si è valutato se il problema era solo relativo al kit Viral, quindi il kit di estrazione è più sensibile degli altri, o se il problema era presente anche nel kit MinElute®. Per tale motivo sono stati osservati nuovamente e confrontati i risultati ottenuti dalle analisi precedenti, in particolare nella prova dove sono stati confrontati i diversi kit di estrazione. Prendendo in esame il controllo negativo di tutti i kit, ci si accorge che per piccoli cambiamenti nei valori della threshold si hanno risultati diversi del controllo negativo, sia con il kit Viral che con il kit MinElute®.
Riportiamo i risultati di tale prova, dove a suo tempo i controlli erano risultati negativi, con il segnale FAM-BHQ per HEV:
Campioni Ct Ultrasens Ct Viral Ct TNAI Ct MinElute
Media (dev.standard) Media (dev.standard) Media (dev.standard) Media (dev.standard)
HEV 250 UI/ml 35,58 (2,45) 34,37 (0,39) Undetermined 35,12 (0,68) HEV 25 UI/ml 41,70 (3,07) 38,00 (2,24) Undetermined 38,05 (1,19) HEV 2,5 UI/ml Undetermined 39,56 (1,84) Undetermined Undetermined
K+ Undetermined 31,13 Undetermined 32,57
K- estr. Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined K- ampl. Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined Come si può osservare dalla riga evidenziata, i valori del controllo negativo sono tutti negativi, quindi conformi. Attraverso un’analisi più dettagliata, variando i livelli della trheshold, si osserva che tali valori cambiano. I valori della threshold impostati per i dati ottenuti nella tabella sopra sono di 0,020. Si riportano in seguito i valori della trheshold ai quali i controlli negativi diventano positivi:
91 Campione K- Threshlod Ultrasens Threshlod Viral Threshlod TNAI Threshlod MinElute Positività < 0,0133 < 0,0196 mai < 0,01978 CAMPIONI K- ULTRASENS TNAI
92
Quindi per il kit Viral, per valori della threshold molto vicini a 0,02 si ha la positivizzazione dei controlli negativi. Proprio perché si riscontra lo stesso problema per i controlli del MinElute® si è
MINELUTE VIRAL
93
potuto concludere che i segnali di positività rilevati nei campioni di HEV alla diluizione di 1,25 UI/ml estratti con il Viral, probabilmente non sono dati da una reale rilevazione e quindi da una maggiore efficienza d’estrazione, ma da un problema di sovrapposizione delle fluorescenze. Per risolvere tale problema di sovrapposizione sono stati ripetuti diversi esperimenti ritestando diverse concentrazioni primer/probe sia di HEV sia del controllo interno.
Nei primi esperimenti sono state variate le concentrazioni dei primer/probe per BVDV: sono stati ritestati diversi titoli di BVDV, partendo da alte concentrazioni in modo da creare le condizioni in cui viene massimizzato il segnale di BVDV: se in tali condizioni non si verifica sovrapposizione del segnale, si può ragionevolmente pensare che anche a concentrazioni inferiori di BVDV non si verificherà tale sovrapposizione. Le concentrazioni di BVDV investigate sono state 6,16 Log TCID50/ml (corrispondenti a 3,16 Log TCID50 in estrazione) fino a 5,16 Log TCID50/ml
(corrispondenti a 2,16 Log TCID50 in estrazione) con passo 0,5 log, e una diluizione a 6,97 Log
TCID50/ml (corrispondenti a 3,97 Log TCID50 in estrazione), ad ogni campione è stato aggiunto 1
µl di controllo interno. Sono stati estratti mediante il protocollo del MinElute®, indicato nel paragrafo 3.3.4, che prevede 200 µl di campione di partenza, i seguenti campioni:
un K+ (costituito da HEV-IS alla concentrazione di 2,5*103 UI/ml), in cui non è stato aggiunto il controllo interno
quattro campioni di plasma presunti negativi per HEV
Per ogni replicato di plasma presunto negativo per HEV, è stata inserita una diversa quantità in estrazione di BVDV (diluizioni indicate sopra). L’eluizione è avvenuta in 35 µl. Sono state preparate quattro mix di amplificazione, con i reagenti della MMX BioSC alle concentrazioni indicate nel paragrafo 3.3.5, con le concentrazioni di primer probe di HEV utilizzate fino a questo momento, ma contenenti diverse concentrazioni di primer/probe di BVDV:
Mix BioSC
Reagente Concentrazione
Primer-F HEV [0,2µM] Primer-R HEV [0,6µM] Primer HEV [0,3µM]
94
Ognuna si differenziava nelle concentrazioni finali molari di primer/probe BVDV:
Mix1 Mix2 Mix3 Mix4
Reagente Concentrazione Concentrazione Concentrazione Concentrazione
Primer-F BVDV [0,2µM]* [0,13µM] [0,10µM] [0,05µM]
Primer-R BVDV [0,2µM]* [0,13µM] [0,10µM] [0,05µM]
Probe BVDV [0,2µM]* [0,13µM] [0,10µM] [0,05µM]
*La mix selezionata è quella standard, utilizzata nelle prove precedenti.
Volume finale di reazione 75 µl, in tutti i casi: 45 µl mix + 30 µl RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (30 µl H2O + 45 µl
mix, indicato come K- ampl) per ciascuna mix. L’amplificazione è stata eseguita su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con condizioni di cicli e temperatura sotto indicate:
Come fluorescenza è stata selezionata FAM-BHQ per rilevare il segnale HEV e HEX-BHQ per rilevare BVDV.
Risultati:
Campioni Ct Mix 1 Ct Mix 2 Ct Mix 3 Ct Mix 4
Plasma + 3,97 Log TCID50 36,82 Undetermined Undetermined Undetermined
Plasma +3,16 Log TCID50 42,01 Undetermined Undetermined Undetermined
Plasma + 2,66 Log TCID50 Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined
Plasma + 2,16 Log TCID50 Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined
K+ HEV 33,88 32,25 31,52 31,94
K- ampl. Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined FAM-BHQ per HEV
95
Campioni Ct Mix 1 Ct Mix 2 Ct Mix 3 Ct Mix 4
Plasma + 3,97 Log TCID50 28,57 29,34 28,26 29,79
Plasma +3,16 Log TCID50 37,74 30,00 32,26 35,05
Plasma + 2,66 Log TCID50 32,07 31,31 34,62 37,96
Plasma + 2,16 Log TCID50 37,51 36,25 35,69 36,32
K+ HEV Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined K- ampl. Undetermined Undetermined Undetermined Undetermined In questa prova si ha conferma che alle concentrazioni di primer/probe precedentemente testate (le stesse della Mix 1) si ha sovrapposizione di fluorescenza di HEX su FAM. Da questa prova risulta che a concentrazioni più basse di probe non si ha sovrapposizione del segnale.
Poiché il segnale di fluorescenza dipende principalmente dalle concentrazioni di probe, è stata eseguita una prova in cui è stata testata la concentrazione di probe 0,10 µM, lasciando inalterate le concentrazioni di primer di controllo interno rispetto alle prove precedenti (0,2 M). Sono stati mantenuti constanti gli altri parametri, come il titolo del controllo interno (quantità in estrazione pari a 2,66 log/TCID50) e le concentrazioni primer/probe per HEV (indicate nella tabella sotto).
Sono stati estratti, mediante il protocollo del kit MinElute®, indicato nel paragrafo 3.3.4, che prevede 200 µl di partenza, i seguenti campioni:
4 plasma negativi
1 campione di HEV-IS (250 UI/ml)
Nel Buffer AL+ RNA carrier è stato effettuato lo spiking di 1 µl di IC per campione (2,66 log/TCID50). L’eluizione è avvenuta in 35 µl. Sono state preparate due mix di amplificazione,
differenziate nella concentrazione di probe di BVDV, ma con i reagenti della MMX BioSC alle concentrazioni finali indicate nel paragrafo 3.3.5, con l’aggiunta dei prime/probe per HEV e dei primer di BVDV riportate in tabella:
96 Mix Reagente Concentrazione Primer-F HEV [0,2µM] Primer-R HEV [0,6µM] Probe HEV [0,3µM] Primer-F BVDV [0,2µM] Primer-R BVDV [0,2µM] Probe BVDV [0,10µM]
Volume finale di reazione 75 µl,: 45 µl mix + 30 µl RNA estratto. In fase di amplificazione è stato inserito anche un controllo negativo di amplificazione (30 µl H2O + 45 µl mix, indicato come K-
ampl.). L’amplificazione è stata eseguita su ABIPrism 7900 HT SDS, in una reazione one-step, con condizioni di cicli e temperatura riportate sotto:
Come fluorescenza è stata selezionata FAM-BHQ per rilevare HEV e HEX-BHQ per rilevare BVDV. Risultati: Campioni Ct Plasma 1 Undetermined Plasma 2 Undetermined Plasma 3 Undetermined Plasma 4 Undetermined HEV 250 UI/ml 35,63 K- ampl Undetermined FAM-BHQ per HEV
97 Campioni Ct Plasma 1 33,60 Plasma 2 32,40 Plasma 3 32,01 Plasma 4 29,68
HEV 250 UI/ml Undetermined K- ampl. Undetermined
Dai risultati ottenuti si osserva che a concentrazione di probe 0,10 µM), non si evidenzia una sovrapposizione della fluorescenza (tutti i campioni sono HEV negativi).
Queste condizioni valgono per il kit di estrazione MinElute®.
Successivamente è stato valutate se la concentrazione sopra stabilita e concentrazioni minori di probe per il controllo interno erano adeguate anche utilizzando il kit di estrazione Viral.
A tale scopo sono stati estratti, mediante il protocollo del kit Viral, indicato nel paragrafo 3.3.4, partendo da 140 l, i seguenti campioni:
6 plasma presunti negativi, dov’è stato inserito il controllo interno
Sono stati preparati due Buffer AVL+ RNA carrier, in uno dei quali è stato effettuato lo spiking di 1 µl di controllo interno (1,66 Log TCID50) per ogni replicato dei plasma negativi.