NEG 6 Plasma pool NEG NEG 23 NEG 12 Plasma pool NEG NEG

12 POS 6 POS 10000

123

5. Discussione

Il lavoro presentato in questa tesi è stato svolto per individuare una metodica NAT di tipo qualitativo, applicabile come test di screening sui pool di plasma destinati alla lavorazione per la produzione di plasma trattato solvente-detergente, in accordo a quanto proposto per la variazione della monografia del plasma trattato con solvente/detergente contenuta nella Farmacopea Europea. La metodica sviluppata è stata di tipo multiplex, quindi prevede la presenza di un controllo interno da aggiungere a partire dalla fase di estrazione, e deve essere capace di individuare come positivo un campione contenente HEV alla concentrazione di 316 UI/ml, valore che sarà utilizzato come controllo positivo nelle analisi di routine sul plasma.

Per l’identificazione della metodica qualitativa NAT sono state valutate due metodiche: la prima sviluppata in house, l’altra già presente in commercio. Inizialmente è stata messa a punto una metodica NAT in house, che prevede l’utilizzo del virus BVDV come controllo interno. Nelle prove preliminari è stata valutata l’efficienza dei primer/probe per il controllo interno ed è stato sviluppato un protocollo di amplificazione per il virus BVDV. Successivamente sono state preparate diluizioni del virus BVDV, utilizzate come controllo interno in campioni costituiti da plasma negativo per HEV ed è stata identificata la quantità di virus da utilizzare negli esperimenti di multiplex. È stata quindi messa a punto la fase di amplificazione ed estrazione di HEV senza l’aggiunta di IC, andando a modificare alcuni parametri di reazione per permettere la rilevazione di HEV anche a basse concentrazioni di virus. Ottimizzate le condizioni nell’estrazione/amplificazione del virus HEV, è stata identificata la quantità minima di controllo interno da utilizzare in multiplex PCR. In seguito è stata effettuata estrazione dello standard HEV, a concentrazioni inferiori a 316 UI/ml (limite richiesto proposto dal PEI per la positività del controllo esterno) con la presenza del controllo interno, infine, per implementare il segnale ottenuto con la multiplex, sono stati confrontati set di primer/probe, kit di estrazioni, master mix presenti in commercio e diversi strumenti di amplificazione. Alla fine il metodo in house è stato ritenuto accettabile per un’eventuale validazione alle condizioni riportare in seguito:

 fase di estrazione: kit MinElute®, partendo da un volume di 200l eluendo in 35l.

 fase di amplificazione: utilizzo della master mix BioSC, con concentrazioni di primer F/R di HEV= 0,2 M e probe HEV= 0,4 M; primer F/R BVDV= 0,2 M e probe BVDV = 0,12 M.

 strumento di amplificazione: ABIPrism 7900 HT SDS.

Il metodo NAT in house è stato confrontato con un kit presente in commercio Real Star di Altona, in base a evidenze di letteratura e a dati riportati in diversi congressi. Nelle prove preliminari per il

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kit Real Star di Altona, che prevede l’utilizzo di un proprio controllo interno, è stato osservato un segnale migliore per la rilevazione sia di HEV sia del controllo interno; per tale motivo sono state testate concentrazioni seriali di HEV in presenza della quantità stabilita di controllo interno. Il metodo presente in commercio prevede:

 fase di estrazione: Viral, partendo da un volume di 140l

 fase di amplificazione: utilizzo del kit Real Star di Altona, con relativo controllo interno  strumento di amplificazione Rotorgene 6000

Il metodo presente in commercio ha rivelato una maggior sensibilità, una maggiore semplicità di esecuzione, ma anche una maggiore facilità per la fase di validazione (è possibile accettare dati ottenuti da studi riportati nel manuale). Per questi motivi il metodo presente in commercio è stato scelto e validato come metodo NAT qualitativo.

In seguito il metodo è stato validato in accordo a quanto richiesto dalla Farmacopea Europea, in particolare sono stati verificati la specificità, il detection limit e la robustezza. Il detection limit risulta essere 48,5 UI/ml, tale valore risulta accettabile in base al titolo previsto per il controllo del metodo, cioè 316 UI/ml, infatti tale valore è superiore a 3 volte il detection limit, quindi è ragionevole pensare che il fallimento della detection del controllo positivo risulterebbe dovuto effettivamente ad una inadeguatezza dell’analisi eseguita piuttosto che ad una fluttuazione statistica.

6. Conclusioni

La crescente diffusione del virus dell’Epatite E (HEV) non solo in paesi in via di sviluppo, ma anche in paesi in cui le buone condizioni igienico-sanitarie non farebbero pensare ad una elevata prevalenza, ha evidenziato la possibilità di trasmissione di tale agente non solo attraverso le vie naturali, ma anche attraverso plasma contaminato. Il rischio di trasmissione tramite trasfusioni è tutt’altro che trascurabile considerando che:

 nella maggior parte dei casi l’infezione ha un decorso asintomatico

 anche quando il decorso è sintomatico la viremia inizia durante la fase asintomatica  ad oggi non è previsto uno screening delle donazioni per il virus HEV

Sebbene ad oggi non risultino casi di trasmissione da plasma derivati, per un particolare prodotto, costituito da plasma trattato con solvente/detergente per l’inattivazione virale (efficace solo per virus con envelope), a garanzia della sicurezza del prodotto, è risultato necessario introdurre un controllo NAT per la ricerca di HEV sul pool di plasma. È stata quindi individuata una metodica NAT multiplex di tipo qualitativo, applicabile come test di screening sui pool di plasma destinati

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alla lavorazione per la produzione di plasma trattato solvente-detergente, in accordo a quanto proposto per la variazione della monografia del plasma trattato con solvente/detergente che verrà apportata alla Farmacopea Europea, prevista per il 2015.

Tale metodica è stata validata secondo quanto richiesto dalle attuali normative Europee e verrà introdotta come controllo routinario da effettuare su ogni pool di plasma destinato alla produzione di plasma trattato S/D.

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7. Ringraziamenti

Alla fine di questo mio lavoro ritengo necessario ringraziare coloro che mi hanno aiutato durante la tesi con suggerimenti, critiche ed osservazioni e chi mi è sempre stato vicino e non ha mai smesso di credere in me.

Desidero innanzi tutto ringraziare la Dott.ssa Elisa Moretti per avermi dato la possibilità di fare l’internato di tesi presso il gruppo BioSC, di cui è la responsabile, per avermi compreso e consigliato e per avermi insegnato a guardare le cose da diversi punti di vista. Il mio grazie più grande va poi alla Dott.ssa Mila Moscardini per la professionalità, per i preziosi insegnamenti e per le numerose ore dedicate alla mia tesi e alla mia preparazione. Ringrazio, inoltre, la Prof.ssa Arianna Tavanti, per la disponibilità dimostrata e i consigli fondamentali.

Il mio grazie va anche a tutto il gruppo BioSC, i cui componenti hanno contribuito consapevolmente o no alla mia formazione ed hanno fatto si che questa esperienza sia stata piacevole: Sara per la dolcezza e l’operosità, Raffaella per la tranquillità e la serietà, Chiara per l’organizzazione e i momenti di svago, Carla per la competenza e il rigore, Arianna per la laboriosità e i suggerimenti, Francesca per la sua preparazione e precisione. Intendo poi ringraziare le persone che hanno vissuto in prima persona, insieme a me questa esperienza, senza le quali questa tesi non esisterebbe: Paola, il vulcano del gruppo, per la sua passione, per aver avuto pazienza e per avermi sempre incoraggiata, e Giampaolo, che nonostante le sue frasi “colme di dolcezza”, grazie alla sua grande esperienza, mi ha insegnato che “chi non sbaglia mai, vuol dire che non lavora”.

Un ringraziamento va anche al gruppo PCR QC-Kedrion, in particolare Antonia Zucchini, Francesca Gracci e Alessia Monti per la collaborazione e la grande disponibilità.

Intendo poi ringraziare tutti gli amici che in modo continuo o discontinuo hanno percorso insieme a me questo cammino, perché ogni persona mi ha lasciato qualcosa. Per cui ringrazio Chi è sempre stato al mio fianco nei momenti felici ma soprattutto nei momenti tristi, Chi da vera coinquilina ha saputo convivere con i miei pregi e i miei difetti, Chi ha reso la vita pisana gioiosa, piena di feste e di allegria, Chi si è seduto accanto a me durante le lezioni scherzando e ridendo, Chi è lontano ed ha dimostrato che tanti chilometri non incidono sull’amicizia, Chi ho chiamato “Giordana”, Chi ballando mi ha fatto sentire la sua presenza, Chi ha brindato con me, Chi mi ha messo una mano sulla spalla e mi ha incoraggiato a non mollare, Chi mi ha mandato un messaggio la sera prima di un esame e Chi mi ha chiamato per sapere com’era andato e Chi, attraverso la danza, mi ha insegnato a rilassarmi ed tenendomi per mano mi ha permesso di immaginare che tutto è possibile.

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Ed infine, ma non per ordine di importanza, perché al primo posto nel mio cuore, ringrazio chi mi è più vicino fisicamente e sentimentalmente: Dario, parte di me, che mi ha supportato e sopportato, e con grande pazienza e volontà mi ha capito amorevolmente e tranquillizzato (++), Matteo, il mio più grande tesoro, per avermi concesso i suoi momenti tranquilli e per avermi incoraggiato anche quando tutto mi sembrava impossibile, ma soprattutto il mio grazie più grande va a Mamma e Papà, per avermi insegnato a credere in ciò che voglio, per essere stati sempre sicuri delle mie possibilità e per avermi reso ciò che sono oggi. Spero che questo mio traguardo sia per tutti e quattro una punta di orgoglio che ripaghi tutti i sacrifici fatti.

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