I tre vettori lentivirali del sistema d’immortalizzazione pLVX-hTERT-p53DD, pLVX-CMYC-hRAS, pLVX-CCND1-CDK4 e il vettore pLVX-LUC sono stati costruiti clonando i sei oncogeni e il gene reporter nel plasmide pLVX-CMV.
L’effettivo inserimento degli inserti nel vettore è stato verificato con una reazione di PCR utilizzando i primer e le condizioni di reazione come descritto nei paragrafi precedenti (Tabella 10). Come mostrato in Figura 33 il clonaggio del gene LUC in pLVX-CMV è rappresentato da un amplificato di 1600bp, il vettore pLVX-CMV vuoto ha dato un amplificato di 750 bp mentre non si osservano bande nel controllo negativo di reazione con sola acqua, indicando il corretto svolgimento della reazione. Le dimensioni degli amplificati sono state determinate con il marker di peso molecolare GenRuler 1 kb DNA ladder (Fermentas-Thermoscientific).
Figura 33: PCR di verifica del clonaggio del gene LUC nel plasmide pLVX-CMV. A: amplificazione del gene LUC con la coppia di primer F1-R2. B: controllo positivo di reazione con pLVX-CMV amplificato con la coppia di primer F1-R2. C: controllo negativo di reazione.
La PCR di screening delle colonie ottenute per il clonaggio degli oncogeni ha confermato il loro inserimento. I geni inseriti nel MCS 1 sono stati amplificati con la coppia di primer R1-F1 mentre quelli inseriti nel MCS 2 con la coppia di primer R2-F2 disegnati sulla base delle sequenze del vettore (Tabella 10). Le dimensioni degli amplificati ottenuti sono riportati in Tabella 19.
Vettore Dimensione amplificato con primer F1-R1
Dimensione amplificato con primer F2-R2
pLVC-CMX 150 bp 600bp
pLVX-hTert-p53DD 3650 bp 450 bp
pLVX-cmyc-hRas 1470 bp 750 bp
pLVX-CCND1-CDK4 1250 bp 1150 bp
Tabella 19: dimensioni degli amplificati per lo screening di PCR di verifica dei clonaggi.
In Figura 34 è mostrato come esempio l’amplificazione del gene della ciclina D1 (CCND1), clonato nel MCS 1, nella lane A e il gene CDK4, clonato nel MCS 2, nella lane B.
Figura 34: PCR di verifica del clonaggio dei geni CCND1 e CDK4 nel plasmide pLVX-CMV. A: amplificazione del gene CCND1 con la coppia di primer F1-R1. B: amplificazione del gene CCND1 con la coppia di primer F2-R2. C: controllo negativo di reazione.
6.2 SEQUENZIAMENTO
I clonaggi sono stati ulteriormente confermati tramite sequenziamento. In Figura 35 è riportato, come unico esempio, l’elettroferogramma del sequenziamento del clonaggio del gene C-MYC che dimostra il corretto inserimento della sequenza genica in frame a valle del promotore PTRE3G. Per la
Figura 35: elettroferogramma del sequenziamento del clonaggio del gene C-MYC nel MCS1 del vettore pLVX-p53DD.
6.3 SYSTEM VALIDATION ASSAYS
6.3.1 LUCIFERASE ASSAY
Per valutare la funzionalità e l’efficienza di espressione del promotore inducibile in risposta a diverse concentrazioni di antibiotico è stato fatto il luciferase assay descritto nel paragrafo 5.5.1. La lettura della luminescenza è stata fatta in triplicato e i valori riportati sono stati ottenuti dalla media delle misurazioni.
Come riportato in Figura 36 le cellule 293T di controllo positivo trasdotte con il vettore pUC119 SWII LUC hanno mostrato un’attività della luciferasi di 400016 RLU (Relative Light Units) indicando un’elevata espressione genica perché controllata dal promotore costitutivo CMV; le cellule non trasdotte usate come controllo negativo, invece, hanno dato una produzione di luce pressoché nulla come atteso.
Figura 36: lettura al luminometro del saggio di luciferasi.
Le cellule 293T trasdotte con il vettore pLVX-LUC e con pCMV-Tet3g, esprimente il transattivatore proteico, sono state mantenute in differenti condizioni di coltura:
Assenza di Tetraciclina
[Tetraciclina] = 200 ng/ml
[Tetraciclina] = 400 ng/ml
[Tetraciclina] = 1 ug/ml
Le cellule trasdotte con pLVX-LUC e pCMV-Tet3G hanno mostrato una produzione di enzima luciferasi direttamente proporzionale all’aumento della concentrazione di Tetraciclina nel terreno di coltura. Come mostrato dai valori, il trattamento con una concentrazione di Tetraciclina di 400 ng/ml ha dato come risultato un valore di RLU doppio rispetto al trattamento con 200 ng/ml, mentre la concentrazione di Tetraciclina di 1 ug/ml ha riportato un valore analogo all’espressione costitutiva del controllo positivo confermando la buona sensibilità e capacità di espressione del promotore inducibile. Dai risultati ottenuti è stata scelta la concentrazione di Tetraciclina di 400 ng/ml da utilizzare nel trattamento dei fibroblasti umani primari per avere un’espressione degli oncogeni inferiore rispetto all’espressione costitutiva utilizzata negli esperimenti di Kendall et al (S.Kendall et al, 2005).
6.3.2 RT-PCR
L’RT-PCR è una tecnica usata per valutare l’espressione genica degli oncogeni clonati. La reazione è stata svolta su fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione con e senza il trattamento con Tetraciclina a 400 ng/ml. Come controllo è stata svolta la reazione di PCR senza retrotrascrizione sull’mRNA di fibroblasti trasdotti con gli oncogeni in presenza dell’induttore (Figura 37 lane 1). I primer utilizzati sono stati disegnati su regioni specifiche degli oncogeni in modo da avere un amplificato di 500 bp. Come mostrato in Figura 37, in assenza di Tetraciclina (lane 2-3) non si ha espressione genica come rappresentato dall’assenza di amplificato per due dei sei oncogeni scelti per l’analisi ovvero hTERT e C-MYC, mentre la reazione svolta su cellule in cui il sistema è stato attivato ha dato amplificati delle dimensioni attese (lane 4-9) per hTERT, C-MYC, CDK4 e CCND1, scelti per l’analisi.
Figura 37: RT-PCR. Lane 1: PCR svolta sull’mRNA non retrotrascritto di fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione trattati con a 400 ng/ml di Tetraciclina; lane 2-3: RT-PCR per hTERT e C-MYC di cellule trattate con il sistema d’immortalizzazione senza la somministrazione della Tetraciclina: lane 4-9: RT-PCR per gli oncogeni
hTERT (4), C-MYC (5), CDK4 (6) e CCND1 (8) in fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione e Tetraciclina a
400 ng/ml.
Dai risultati ottenuti è stato possibile evincere che la concentrazione di Tetraciclina di 400 ng/ml scelta sulla base dei valori del luciferase assay ha permesso l’espressione degli oncogeni nei fibroblasti umani trattati in modo rilevante.
6.4 CELL CHARACTERIZATION ASSAYS
6.4.1 MORPHOLOGICAL ANALYSIS
Le colture di fibroblasti sono state osservate al microscopio ottico per un’analisi morfologica, come descritto nel paragrafo 5.6.1, per identificare differenze e anormalità tra cellule non trasdotte e cellule trasdotte con il mix di oncogeni e il transattivatore in presenza e assenza di
Tetraciclina a 400ng/ml. Le immagini sono state confrontate con quella di una coltura di fibroblasti non immortalizzati ai quali non è mai stata somministrata la Tetraciclina (Figura 38) con lo scopo di avere un controllo ulteriore di cellule normali che non hanno manifestato un fenotipo alterato.
Figura 38: monolayer di fibroblasti primari umani non immortalizzati.
Sono state allestite una coltura di fibroblasti non trasdotti e due colture di fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione mantenute in coltura per lo stesso numero di passaggi, alle quali non è stata aggiunta la Tetraciclina nel terreno di coltura.
Figura 39: fotografie a microscopio ottico con ingrandimento 10X di fibroblasti umani non trasdotti e trasdotti con il sistema d’immortalizzazione (campione 1 e 2) tenuti in coltura senza Tetraciclina.
Com’è possibile osservare nella Figura 39, le tre immagini mostrano un fenotipo cellulare identico sia tra loro sia con l’ulteriore controllo di Figura 38. Questo indica che in assenza dell’antibiotico
attivatore non si ha l’espressione dei transgeni e i due campioni di cellule trasdotte non mostrano caratteristiche morfologiche differenti dalle cellule normali.
Figura 40: fotografie a microscopio ottico con ingrandimento 10X di fibroblasti umani non trasdotti e trasdotti con il sistema d’immortalizzazione (campione 1 e 2) tenuti in coltura con Tetraciclina concentrata 400 ng/ml.
Aggiungendo al terreno di coltura delle tre piastre la Tetraciclina concentrata 400 ng/ml e mantenendoli in coltura per alcuni giorni, non si è osservata un’alterazione morfologica delle cellule normali come atteso (Figura 40). Un diverso risultato avrebbe significato un’alterazione del metabolismo cellulare spontaneo o un effetto indesiderato dell’antibiotico sulle cellule. I due campioni di fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione, invece, hanno formato delle strutture dette foci com’è possibile vedere nell’immagine centrale e destra di Figura 40. Questi sono aggregati di cellule sovrapposte che sono in grado di crescere le une sulle altre andando a formare delle strutture tridimensionali. I foci indicano che l’espressione degli oncogeni ha permesso l’acquisizione di caratteristiche diverse dalle cellule non trattate: le cellule hanno acquisito la capacità di crescere in multistrati sovrapposti perdendo l’inibizione da contatto. Queste caratteristiche sono comuni ai fibroblasti tumorali indicando l’alterazione dei pathway cellulari da parte degli oncogeni espressi. Le strutture multistrato sono state analizzate con un microscopio semi-confocale come mostrato in Figura 41 dove è possibile vedere più in dettaglio l’organizzazione dei foci.
Figura 41: fotografia al microscopio semiconfocale dei foci di fibroblasti.
Dopo queste osservazioni è stata rimossa la tetraciclina dal terreno. Mantenendo le cellule in coltura, com’è possibile vedere dalla Figura 42, queste hanno riacquisito un fenotipo normale con un’elevata la capacità proliferativa e non hanno formato foci durante tutto il rimanente periodo di coltura.
Figura 42: fotografie a microscopio ottico con ingrandimento 10X di fibroblasti umani non trasdotti e trasdotti con il sistema d’immortalizzazione (campione 1 e 2) ai quali è stata rimossa la Tetraciclina.
Dai risultati ottenuti è stato possibile ipotizzare che gli oncogeni alterano le vie cellulari permettendo alle cellule di acquisire alcuni aspetti delle due caratteristiche principali della trasformazione tumorale: la perdita dell’inibizione da contatto e l’indipendenza dall’ancoraggio. Tuttavia, l’acquisizione di questo fenotipo tumorale sembra essere reversibile e questo fa presupporre che l’espressione degli oncogeni a un livello inferiore rispetto a quello del promotore CMV costitutivo non alteri la cellula in modo irreparabile ma ne permetta una modulazione controllata, a differenza della trasformazione tumorale dove le cellule non sono più in grado di riacquisire le normali caratteristiche.
I foci cellulari sono stati tripsinizzati e le cellule propagate in coltura per essere usate nei test successivamente descritti per avere una popolazione cellulare arricchita di fibroblasti immortalizzati.
6.4.2 SOFT AGAR ASSAY
Dopo la valutazione dei risultati ottenuti dall’analisi morfologica, è stato fatto il saggio del soft agar (paragrafo 5.6.2) perché la formazione di foci ha suggerito l’inizio della trasformazione tumorale nei fibroblasti trattati, quindi, il test è stato fatto per valutare il livello di tumorigenicità cellulare.
Per lo svolgimento del saggio sono state usate cellule epiteliali mammarie come controllo positivo e, come è possibile vedere dalla Figura 43, queste hanno formato colonie nella matrice gelatinosa di soft agar con un livello di tumorigenicità di circa il 100%. Il controllo negativo è stato fatto con fibroblasti umani primari non trasdotti con gli oncogeni e non hanno formato colonie come atteso. Nell’immagine centrale è possibile vedere che anche i fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione attivato da Tetraciclina non hanno formato colonie.
Figura 43: fotografie con microscopio da dissezione del soft agar di fibroblasti normali come controllo negativo, fibroblasti immortalizzati con Tetraciclina a 400 ng/ml e cellule epiteliali tumorali mammarie derivate da tessuto come controllo positivo.
Questo risultato indica che i fibroblasti in cui è stata attivata l’espressione degli oncogeni, non hanno acquisito le caratteristiche tumorali d’indipendenza dall’ancoraggio e mancanza d’inibizione da contatto, da permettergli di formare colonie in una matrice gelatinosa. Si pensa che gli oncogeni abbiano permesso la formazione di foci ma il loro livello di espressione non abbia permesso l’acquisizione del fenotipo tumorale.
6.4.3 WOUND HEALING ASSAY
Come descritto nel paragrafo 5.6.3 il wound healing assay è stato fatto per valutare la capacità proliferativa delle cellule analizzate. In piastre da 3,5 mm di diametro sono stati seminati in duplicato fibroblasti giovani, ovvero propagati per pochi passaggi, fibroblasti quasi senescenti e fibroblasti trattati con il sistema d’immortalizzazione attivato da Tetraciclina 400 ng/ml mantenuti in coltura parallelamente ai fibroblasti quasi senescenti. Il movimento e il tempo impiegato dalle cellule per riempire i gap è stato valutato analizzando le fotografie dei tre graffi tracciati a tempo zero, dopo 8 ore e dopo 24 ore d’incubazione.
Osservando le fotografie, com’è possibile vedere nella Figura 44, a tempo zero il gap creato dal graffio fatto sul monostrato cellulare è ben visibile per tutti e tre i campioni. Come gap di riferimento è stato scelto quello centrale dove il monostrato cellulare era maggiormente a confluenza.
Figura 44: fotografie a tempo zero dei gap centrali di una piastra con fibroblasti giovani, fibroblasti quasi senescenti e fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione mantenuti in coltura con Tetraciclina a 400 ng/ml.
Dopo un periodo d’incubazione di otto ore, come mostrato in Figura 45, il gap è sempre ben visibile ma nel caso dei fibroblasti giovani e dei trattati con il sistema d’immortalizzazione attivato è possibile vedere alcune cellule che iniziano a riempire lo spazio vuoto rendendone i confini meno netti rispetto al tempo zero. Questi risultati dipendono anche dal breve periodo d’incubazione trascorso dalla generazione del gap perché i fibroblasti impiegano circa 20 ore per replicarsi.
Figura 45: fotografie dei gap centrali dopo otto ore d’incubazione di una piastra con fibroblasti giovani, fibroblasti quasi senescenti e fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione mantenuti in coltura con Tetraciclina a 400 ng/ml.
Osservando la Figura 46 è possibile vedere che dopo 24 ore d’incubazione, i fibroblasti giovani hanno invaso il gap centrale riempiendolo come atteso dal momento che le cellule sono metabolicamente molto attive. I fibroblasti quasi senescenti, invece, anche a distanza di un periodo più lungo del loro tempo di replicazione, non sono stati in grado di riempire lo spazio che appare sempre ben visibile. Questo perché le cellule hanno un metabolismo e una capacità proliferativa rallentati a causa del blocco del ciclo cellulare indotto dalla senescenza. I fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione e tenuti in coltura con Tetraciclina a 400 ng/ml per un
periodo analogo a quello dei fibroblasti quasi senescenti, sono stati in grado di invadere il gap e di riempirlo in modo paragonabile alle cellule giovani provenienti dallo stesso tessuto d’origine.
Figura 46: fotografie dei gap centrali dopo 24 ore d’incubazione di una piastra con fibroblasti giovani, fibroblasti quasi senescenti e fibroblasti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione mantenuti in coltura con Tetraciclina a 400 ng/ml.
La capacità proliferativa dei fibroblasti immortalizzati è indice dell’attività del mix di sei oncogeni a livello cellulare perché permette ai fibroblasti di proliferare maggiormente rispetto alle cellule non trattate. Questo indica che l’espressione degli oncogeni, determinata dalla concentrazione di antibiotico somministrato, ha permesso alle cellule di ritardare l’entrata in senescenza e mantenere elevata la loro capacità di proliferazione e migrazione sulla piastra.
6.4.4 CELL PROLIFERATION ASSAY WST-1
Tramite il cell proliferation assay WST-1 è stata valutata la proliferazione e la vitalità cellulare mediante un’analisi spettrofotometrica. Il sale di tetrazolio WST-1 è ridotto a formazano solubile dalle deidrogenasi mitocondriali. Questo porta a un cambiamento di colore del mezzo di coltura da arancio a giallo direttamente correlata all’attività enzimatica.
Dopo un’incubazione di 4 ore con WST-1 delle cellule piastrate in una 96-well come descritto nel paragrafo 5.6.4, è stata fatta la misura dell’assorbanza con una lunghezza d’onda di 450 nm in un lettore per piastre ELISA. I valori riportati in Figura 47 sono stati ottenuti dalla media delle misurazioni di otto pozzetti fatte per ogni diverso campione cellulare analizzato in modo da rendere il risultato statisticamente significativo.
Figura 47: grafico dei valori della lettura dell’assorbanza a una lunghezza d’onda di 450 nm dei fibroblasti incubati 4 ore con WST-1. 1: fibroblasti quasi senescenti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione senza tetraciclina; 2: fibroblasti non trasdotti quasi senescenti; 3: fibroblasti non trasdotti giovani; 4: fibroblasti giovani trasdotti con il sistema d’immortalizzazione e Tetraciclina 400 ng/ml; 5: fibroblasti mantenuti in coltura per numerosi passaggi trasdotti con il sistema d’immortalizzazione e Tetraciclina 400 ng/ml.
Dal confronto dei dati ottenuti è possibile vedere che i fibroblasti non trattati (Figura 47.2) quasi senescenti hanno un’attività enzimatica inferiore rispetto agli altri campioni indice di una scarsa proliferazione e vitalità cellulare. Infatti, quando le cellule si avvicinano alla senescenza, rallentano il loro metabolismo bloccando le vie di proliferazione. Un risultato analogo è stato ottenuto con i fibroblasti quasi senescenti trasdotti con il sistema d’immortalizzazione senza Tetraciclina (Figura 47.1) dimostrando che i vettori utilizzati non hanno un’espressione basale che altera le vie cellulari in assenza di antibiotico. I fibroblasti giovani non trattati (Figura 47.3), ovvero mantenuti in coltura per pochi passaggi, hanno prodotto una elevata quantità di formazano solubile perché sono in attiva proliferazione e l’attività enzimatica è molto elevata per la necessità della respirazione cellulare. Un risultato analogo è osservabile nei fibroblasti giovani trattati con il sistema d’immortalizzazione attivato (Figura 47.4). I fibroblasti trattati con il sistema d’immortalizzazione e Tetraciclina a 400 ng/ml, mantenuti in coltura parallelamente ai fibroblasti quasi senescenti hanno mostrato un’elevata attività enzimatica paragonabile a quella delle cellule giovani (Figura 47.5). Questo dato, in accordo con i risultati ottenuti dal wound healing assay, indica una capacità proliferativa e un’attività enzimatica molto superiori rispetto alle cellule mantenute in coltura per lo stesso tempo ma senza essere trasdotte con gli oncogeni. I transgeni introdotti, quindi, espressi a un livello inferiore rispetto all’espressione costitutiva regolata dal promotore forte CMV non inducibile, sembrano essere in grado di mantenere le cellule in coltura per un periodo di tempo maggiore rispetto a quello fisiologico mantenendo il metabolismo cellulare attivo.
6.4.5 METHYLATION ASSAY
Per valutare come gli oncogeni trasdotti influenzano l’espressione genica dei fibroblasti è stato svolto il saggio di metilazione (paragrafo 5.6.5). Tramite questo test è stato possibile determinare il numero di copie e il livello di metilazione degli oncosoppressori. L’ipermetilazione delle isole CpG nelle regioni di regolazione determina la condensazione della cromatina e quindi l’inattivazione della trascrizione genica per cui sono stati analizzati gli oncosoppressori principali riportati in Figura 48 la cui alterazione è frequente in molti tipi di tumori riportati in letteratura.
Figura 48: principali oncosoppressori le cui regioni di regolazione sono state analizzate con il saggio di metilazione.
L’analisi dei risultati è di tipo comparativo perché è fatto un confronto tra il pattern di metilazione delle cellule analizzate e quello di un sistema di riferimento. Il test è stato svolto su fibroblasti immortalizzati e mantenuti in coltura con Tetraciclina a 400 ng/ml per numerosi passaggi e fibroblasti non trattati come controllo.
Dai risultati dell’elettroforesi capillare, non sono state osservate differenze tra i due tipi di campioni per tutti i geni tumor suppressor analizzati; non sono state riscontrate alterazioni geniche come delezioni o duplicazioni.
Sembra che il livello di espressione degli oncogeni non causi alterazioni a livello epigenetico. Questo aspetto è di fondamentale importanza perché indica il mantenimento della stabilità e dell’espressione genica fisiologica della cellula importante per impedire ai fibroblasti di sfuggire ai principali controlli cellulari provocando la completa trasformazione tumorale. I risultati ottenuti si accordano con la definizione di immortalizzazione cellulare perché le cellule trattate si sono mostrate capaci di proliferare rimandando l’entrata in senescenza, come è stato possibile capire dai test precedenti, mantenendo il genoma stabile senza gravi alterazioni irreversibili.
6.4.6 MICROSATELLITE ANALYSIS
Il saggio dei microsatelliti, descritto nel paragrafo 5.6.6, è stato svolto perché la loro instabilità è un potenziale fattore di trasformazione tumorale. I marcatori scelti per la reazione specifici per tumori come i melanomi sono: NR 21, BAT 26, BAT 25, NR 24, NR 22.
I risultati dell’elettroforesi capillare sono stati analizzati da un software specifico che non ha rilevato anomalie tumorali nell’analisi dei microsatelliti dei fibroblasti trasdotti con gli oncogeni a confronto con il pattern di fibroblasti normali e tumorali di riferimento (Figura 49).
A B C D E
Figura 49: grafici dei marcatori specifici del saggio dei microsatelliti. In alto sono mostrati i profili dei fibroblasti normali, nella fila centrale quelli trattati con il sistema d’immortalizzazione attivato e in basso quelli tumorali di riferimento. I marcatori sono: A: BAT 25, B:BAT 26, C:NR 21, D:NR 22, E: NR 24.
Anche questo test, come il test di metilazione, ha confermato la stabilità a livello genetico delle cellule analizzate confermando la non tumorigenicità dei fibroblasti immortalizzati.
6.4.7 CARIOTIPIZZAZIONE
È stata fatta un’ulteriore analisi della stabilità cromosomica tramite l’analisi del cariotipo descritta nel paragrafo 5.6.7. Dalle osservazioni al microscopio ottico delle metafasi fatta dal personale del laboratorio di citogenetica dell’ospedale Santa Chiara, sembrano non essere presenti aberrazioni cromosomiche come traslocazioni, delezioni e duplicazioni.
7 DISCUSSIONE
Le cellule primarie possono andare incontro a un numero finito di divisioni scoperto da Leonard Hayflick, detto limite di Hayflick, oltre il quale entrano in senescenza. La senescenza cellulare è una fase in cui le cellule rimangono vitali bloccando la loro capacità di proliferazione. Questo stato