IMMORTALIZZAZIONE CON ONCOGENI

La maggior parte delle tecniche di immortalizzazione e trasformazione sono basate sull’utilizzo di virus o proteine virali come di SV40, HPV e Adenovirus di tipo 5 insieme alla co-espressione di proteine oncogeniche come Myc e Ras o Tert. Lo studio dei meccanismi d’azione di questi metodi ha permesso di raggiungere numerosi progressi nell’identificazione e nella caratterizzazione delle combinazioni geniche coinvolte nelle fasi di pre-cancerogenesi nell’uomo. A questo scopo è stato allestito nel 2005 da S. Kendall e collaboratori un sistema basato sull’espressione di proteine esclusivamente cellulari per ricreare le alterazioni delle vie che permettono alle cellule di sfuggire alla senescenza e procedere verso l’immortalizzazione e, in caso di continua espressione, alla trasformazione tumorale. Le proteine scelte inattivano i tumor suppressor pRB e p53, stimolano la proliferazione cellulare e la stabilità telomerica. L’innovazione del mix proteico consiste nell’essere universale e, quindi, utilizzabile per quei tipi cellulari umani non immortalizzabili con le metodiche precedentemente descritte. L’espressione costitutiva delle proteine ha dimostrato la capacità di indurre le cellule a sviluppare un fenotipo tumorale caratterizzato dall’abilità di proliferare in maniera incontrollata senza rispondere a segnali apoptotici e antiproliferativi, dall’angiogenesi, invasione e capacità di formare metastasi in vivo (Hanahan et al, 2000). Molte informazioni sono note sui processi molecolari delle cellule tumorali ma poco è conosciuto su come i pathway guidano collettivamente il processo di trasformazione. È stato dimostrato che numerose cellule

umane sia di derivazione epiteliale (prostata, reni, ovaio e ghiandola mammaria) sia mesenchimali (fibroblasti e mioblasti) possono essere trasformate tramite l’espressione degli antigeni T di SV40 e le proteine RasG12V e hTert (O’Hayer et al, 2005). Sia hTert sia Ras sono chiaramente coinvolte nella tumorigenesi umana favorendo una maggiore stabilità genomica, la proliferazione cellulare, l’invasione e la capacità metastatica. È stato identificato un set di proteine che, se co-espresse con hTert e Ras, sono in grado di rimpiazzare le oncoproteine virali di SV40 promuovendo la tumorigenicità. Alcune delle oncoproteine sono state modificate tramite mutazioni per essere rese più attive e per sfuggire ai sistemi di degradazione cellulari. Le proteine utilizzate sono c-MycT58A, hRasG12V, Cdk4R24C, ciclina D1, hTert e p53DD.

C-MYC è un proto-oncogene solitamente sovraespresso in molti tipi di tumore umano dove è noto

svolgere un ruolo di primaria importanza. È un fattore di trascrizione pleiotropico coinvolto in molte funzioni cellulari come la proliferazione, la crescita cellulare, il differenziamento, stabilità genomica e morte cellulare. La tumorigenesi indotta da c-Myc è caratterizzata dall’attivazione di pathway di oncosoppressori intrinseci coinvolti dei checkpoint cellulari e nell’apoptosi. L’attivazione di queste vie di segnale porta le cellule normali alla morte ma non quelle tumorali dove i meccanismi di sicurezza sono bypassati. Per mantenere le normali funzioni cellulari, l’espressione di c-Myc è strettamente controllata sia a livello trascrizionale sia traduzionale. La mutazione T58A è stata scelta per la sua maggiore stabilità rispetto alla wild-type. Normalmente i livelli della proteina sono regolati dagli effettori della via di Ras e il residuo amminoacidico Thr58 è fosforilato e riconosciuto dall’ubiquitina ligasi Fbw7 che permette la sua degradazione. La sostituzione amminoacidica permette un aumento dei livelli proteici citoplasmatici, riducendo l’apoptosi e incrementando l’attività proliferativa (Yeh et al, 2004). La mutazione T58A permette una diminuzione dell’apoptosi approssimativamente del 50% rispetto al wild-type non mutato. La proteina permette anche un aumento dell’emivita di RasG12V.

Ras è una proteina codificata dal proto-oncogene RAS (Harvey rat sarcoma viral oncogene

homolog). E’ un piccolo enzima ad attività GTPasica della superfamiglia di Ras coinvolto nella via delle MAP chinasi. H-Ras è implicato nella regolazione del ciclo cellulare in risposta a stimolazione da parte di fattori di crescita. Quando i fattori di crescita si legano ai recettori di membrana, attivano la trasduzione del segnale mediata da secondi messaggeri che porta la cellula a dividersi. La proteina h-Ras è tipicamente associata alla membrana cellulare attraverso un gruppo isoprenile ed è coinvolta nei primi passaggi della trasduzione. Si attiva legando il GTP permettendo la

propagazione del segnale proveniente dai recettori di membrana e si disattiva quando il GTP è convertito a GDP. Essendo un proto-oncogene, alcune mutazioni a carico del gene HRAS possono convertire cellule normali a cancerose. Alcune mutazioni non ereditarie, dette somatiche, sono accumulate normalmente durante la vita cellulare e sono state associate al cancro alla vescica. Una delle più frequenti è la mutazione Gly12Val in cui la glicina in posizione 12 è sostituita dalla valina. Questa proteina alterata è permanentemente attiva a livello citoplasmatico portando la cellula a una crescita non dipendente da fattori esterni.

Cdk4 è una proteina chinasi ciclina dipendente che regola la fosforilazione iniziale di pRB

promuovendone il rilascio del fattore di trascrizione E2F come trattato nel paragrafo 3.1.2.1. Da studi condotti su melanomi, la mutazione Arg24Cys (R24C) impedisce il legame dell’inibitore specifico di Cdk4, p16INK4a, predisponendo le cellule umane a una tumorigenicità ereditaria. Queste osservazioni suggeriscono il ruolo di oncogene dominante di CDK4 mutato la cui proteina è resistente alla fisiologica inibizione da parte di p16INK4a. La verifica di queste ipotesi è stata ottenuta con un la tecnologia knock-in Cre-loxP mediata in cellule della linea germinale. La presenza della proteina mutata ha dimostrato una iperfosforilazione delle proteine della famiglia RB in fibroblasti murini derivati da topi CDK4R24C omozigoti (Sushil et al, 2002).

Il ruolo della ciclina D è stato trattato nel paragrafo 3.1.2.1. È stato scelto il tipo D1 perché è stata dimostrata la sua iper-espressione in tutti i casi di cellule di linfoma e per questo è associata a molti dei fenotipi tumorali.

L’espressione di hTERT è necessario per la stabilità genomica e l’allungamento dei telomeri in modo da impedire alla cellula l’entrata in senescenza o l’apoptosi. È espressa solo la subunità catalitica perché la componente a RNA Terc sembra essere ubiquitaria. L’attività enzimatica è quindi determinata dall’espressione solo in alcuni tipi cellulari della parte proteica Tert come descritto nel paragrafo 3.1.3.3.

La funzione della proteina p53 è stata trattata nel paragrafo 3.1.2.3. Nel mix di oncogeni è stata scelta la variante p53DD, un dominante negativo che impedisce la normale attività delle proteine p53 endogene.

Gli oncogeni sono stati clonati da Kendall e collaboratori in vettori retrovirali sotto il controllo di un promotore forte e sono stati usati per trasdurre tipi cellulari diversi come cellule umane epiteliali mammarie e muscolari dimostrando la loro capacità di trasformazione tumorale solo in

presenza di tutti e sei gli oncogeni. Nelle cellule trattate solo con cinque oncogeni, è stato mantenuto un fenotipo paragonabile alle cellule non trattate. Le cellule così trasformate hanno dimostrato la capacità di crescere senza la necessità di adesione a un substrato, come mostrato dalla formazione di colonie in soft agar e hanno portato alla formazione di masse tumorali se iniettate sottocute in topi immunocompromessi indicando la loro tumorigenicità.

Dagli studi fatti è stato dimostrato che l’espressione costitutiva dei sei oncogeni altera i pathway cellulari principali per la regolazione del ciclo cellulare e i checkpoint necessari a impedire alla cellula la trasformazione, fornendo un valido strumento sia per ottenere cellule tumorali non ancora disponibili, sia per lo studio del processo di immortalizzazione e carcinogenesi (S.Kendall et al, 2005).