Prima di procedere con il trattamento delle colture di fibroblasti con i vettori virali costruiti, è stato necessario validare il sistema d’immortalizzazione per verificarne il funzionamento e definire le migliori condizioni di espressione.
5.5.1 LUCIFERASE ASSAY
Il luciferase assay è un saggio funzionale fatto per quantificare l’espressione del gene reporter (Alam et al, 1990) e valutare l’efficienza di espressione del promotore inducibile PTRE3G in risposta a
concentrazioni diverse di Tetraciclina.
È stato utilizzato il Britelite Plus Luminescence Reporter Gene Assay System Kit (PerkinElmer®) specifico per l’enzima luciferasi della lucciola americana Photynus pyralis clonata nel vettore lentivirale pLVX-CMV. Il kit utilizzato permette una migliore rilevazione della luce prodotta dalla reazione perché la sua formulazione rende l’impulso luminoso più duraturo e a elevata intensità. Come sistema cellulare modello per l’applicazione del saggio, sono state utilizzate le cellule HEK 293T. Le cellule sono state staccate per tripsinizzazione, centrifugate e risospese in terreno DMEM per ottenere una sospensione cellulare con una concentrazione di 1 x 106 cellule/ml.
Il kit è formato dal substrato liofilizzato Britelite Plus e dal buffer di ricostituzione Britelite Plus. Al substrato sono stati aggiunti 10 ml di buffer ottenendo una soluzione omogenea (Britelite Plus Reagent). Per avere una misurazione ottimale è stato usato un ugual volume di mezzo di coltura e di Britelite Plus Reagent. In una piastra 96 well OptiPlate™ sono stati aggiunti 100 ul di sospensione cellulare contenenti 1 x 105 cellule e 100 ul di Britelite Plus Reagent mischiando bene il contenuto. Le cellule 293T sono state trasdotte con il vettore pLVX-LUC e il transattivatore pCMV-Tet3G e trattate con concentrazioni di Tetraciclina di 200 ng/ml, 400 ng/ml e 1 ug/ml (Figura 25); come controllo positivo di reazione sono state utilizzate cellule 293T trasdotte con il vettore PUC 119 SWII-LUC che esprime il gene della luciferasi in modo costitutivo perché sotto il controllo del promotore CMV; è stato scelto questo vettore perché il promotore del sistema d’immortalizzazione contiene un promotore CMV inducibile quindi la sua massima espressione è
attesa paragonabile a quella dell’analogo costitutivo. Come controllo negativo sono state usate cellule 293T non trasdotte mentre il bianco è stato fatto con 100 ul di terreno DMEM e 100 ul di Britelite Plus Reagent. I campioni sono stati caricati in doppio sulla piastra.
Figura 25: schema della piastra 96 well allestita per il luciferase assay.
La piastra è stata lasciata incubare a temperatura ambiente per almeno 1 minuto per permettere una completa lisi cellulare. Per una maggiore sensibilità, la misura della luminescenza è stata fatta entro 15 minuti dall’aggiunta del reagente data la breve emivita dell’enzima e della funzionalità dei reagenti. La piastra è stata inserita nel luminometro OPTIMA (BMG Labtech) per la misura della luminescenza emessa. Tramite l’OPTIMA Software sono stati raccolti e analizzati i dati.
5.5.2 RT-PCR
La reverse trascriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) è una tecnica usata per valutare l’espressione genica. Si basa sulla retrotrascrizione dell’RNA messaggero della cellula in cDNA con conseguente amplificazione delle regioni specifiche di interesse tramite PCR. La reazione è stata fatta per verificare l’espressione dei transgeni introdotti nei fibroblasti per trasduzione.
L’RT-PCR si articola in tre fasi:
1. Estrazione dell’RNA messaggero 2. Retrotrascrizione del cDNA 3. PCR
L’mRNA è stato estratto da fibroblasti primari trattati con il sistema d’immortalizzazione sia con Tetraciclina a concentrazione di 400 ng/ml sia senza Tetraciclina come controllo negativo dell’attivazione dell’espressione genica. È stato usato l’RNeasy Mini Kit (Qiagen) seguendo i passaggi riportati in Figura 26.
Figura 26: passaggi per l’estrazione dell’mRNA cellulare tramite RNeasy Mini Kit (Qiagen).
L’estrazione è stata fatta su un massimo di 1 x 107 cellule.
L’mRNA estratto è stato quantificato al NanoDrop. Per rimuovere qualsiasi traccia di DNA genomico dalla preparazione di RNA è stata fatta la seguente reazione per ogni campione:
1 ug RNA
1 ul 10X Reaction Buffer con MgCl2
1 ul DNase I, RNase-Free (1U)
Nuclease-Free water
Volume finale 10 ul
Tabella 11: reazione allestita per eliminare qualsiasi traccia di DNA genomico.
La reazione è stata incubata a 37°C per 30 minuti. Successivamente è stato aggiunto l’agente chelante EDTA 50 mM per impedire l’idrolisi dell’RNA in presenza di cationi divalenti al calore; la mix è stata incubata a 65°C per 10 minuti. L’RNA così ottenuto è stato quantificato.
La retrotrascrizione dell’mRNA è stata fatta usando il Reverse Transcriptase Assay Kit (INVITROGEN- Life Technologies). La mix di reazione è stata allestita in tubini sterili da PCR tenuti in ghiaccio :
2 ug RNA stampo
1 ul Random Hexamer primer
Nuclease-Free water (per raggiungere 12 ul finali)
4 ul 5x Reaction Buffer
1 ul RiboLock RNase Inhibitor (20 U/ul) 2 ul 10 mM dNTP Mix
1 ul RevertAid RT (200 U/ul)
Volume totale 20 ul
Tabella 12: mix di reazione di retrotrascrizione dell’mRNA.
Ogni reazione è stata incubata per 5 minuti a 25°C e per 60 minuti a 44°C. Successivamente, è stata fatta la disattivazione a 92°C per 10 minuti.
Dopo aver ottenuto il cDNA delle cellule è stata fatta una reazione di PCR (condizioni in Tabella 14) per valutare l’espressione genica degli oncogeni; come controllo è stata svolta la reazione anche sull’mRNA delle cellule trattate. Sono stati utilizzati primer specifici (Tabella 13) per tutti i fattori
d’immortalizzazione, disegnati sulla base della sequenza genica in modo da amplificare una regione di 500 bp.
Oncogene amplificato Tipo primer Sequenza primer
hTERT Senso 5’-TGGCTGTGCCACCAAGCAT-3’
Antisenso R1 5’ - CACACCGGCCTTATTCCA - 3’
P53DD Senso 5’- ATGCCTTGCAAAATGGCG -3’
Antisenso R2 5’- TTAAAGCAGCGTATCCACA- 3’
C-MYCT58A Senso 5’- TTTCCACACCTGGTTGC-3’
Antisenso R1 5’ - CACACCGGCCTTATTCCA - 3’
hRASG12V Senso 5’- TGGCAAACACACACAGGA-3’
Antisenso R2 5’- TTAAAGCAGCGTATCCACA- 3’
CDK4R24C Senso 5’- -3’
Antisenso R2 5’- TTAAAGCAGCGTATCCACA- 3’
CCND1 Senso 5’- TTCTGCCTGCTGGGGAG-3’
Antisenso R1 5’ - CACACCGGCCTTATTCCA - 3’
Tabella 13: primer oncogeni-specifici per la reazione di RT-PCR.
Step Temperatura Tempo N° cicli
Denaturazione iniziale 94°C 3 min 1
Denaturazione 94°C 30 sec 30
Annealing 50°C 30 sec 30
Estensione 72°C 30 sec 30
Estensione finale 72°C 5 min 1
Tabella 14: condizioni di reazione utilizzate per la PCR sul cDNA.
Al termine del ciclo, la reazione è stata corsa su gel d’agarosio all’1X con bromuro d’etidio per verificare la presenza degli amplificati.