METHYLATION ASSAY

Per analizzare i cambiamenti nell’espressione genica è stato svolto il Methylation-Specific Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MS-MLPA®) MRC-Holland. Il test è stato fatto per determinare il numero di copie e lo stato di metilazione di geni oncosoppressori in una singola reazione di multiplex PCR.

Il DNA eucariotico è normalmente metilato sulle citosine dei dinucleotidi CpG, mentre le isole CpG, presenti in promotori e regioni di regolazione, sono abbondanti di sequenze di dinucleotidi CpG con citosine non metilate. Una loro anormale ipermetilazione porta la cromatina a condensare causando il silenziamento di geni tumor suppressor. Sono stati scoperti pattern di metilazione anormali associati a molte neoplasie umane.

Ogni reazione MS-MLPA forma amplificati di PCR di 64-500 nucleotidi che sono separati per elettroforesi capillare. L’amplificazione non è fatta sulla base del campione di DNA ma sulle sonde utilizzate che ibridano il campione in regioni specifiche. Le sonde usate hanno una lunghezza di 55- 80 nt e ognuna è formata da due oligonucleotidi che vanno a ibridare il campione di DNA disponendosi l’una accanto all’altra in modo da poter essere ligate insieme. Dopo la loro ligation si forma un solo filamento che sarà amplificato per PCR tramite una coppia di primer universali (Figura 32).

Figura 32: reazione MS-MLPA.

Ogni sonda utilizzata ha una lunghezza caratteristica che ne permette una veloce e semplice identificazione. Le sonde utilizzate sono state disegnate in modo da essere specifiche per sequenze ricche di dinucleotidi CpG e servono per determinare sia il numero di copie sia lo stato di metilazione del DNA target. Queste ibridano sequenze di DNA che contengono un sito di taglio per l’enzima di restrizione HhaI metilazione-sensibile. L’analisi del numero di copie delle sequenze target è stata fatta analizzando il tipo e il numero di sonde amplificate presenti in metà della miscela di reazione (Figura 32 3A) mentre la parte rimanente è stata trattata con l’enzima HhaI

(Figura 32 3B). Le sonde legate a sequenze non metilate sono ligate e tagliate dall’enzima, quindi non sono amplificate dalla reazione di PCR. Quando invece, la sequenza bersaglio presenta una metilazione, la digestione enzimatica è impedita permettendone l’amplificazione.

L’analisi della MS-MLPA non è assoluta ma relativa perché è fatto un confronto tra il pattern di amplificazione del campione e quello di un sistema di riferimento.

È stata utilizzata la ME002-C1 MS-MLPA® probemix, contenente un mix di sonde specifiche per le aberrazioni di metilazione di molti tipi di tumori riportati in letteratura. La miscela contiene 27 sonde MS-MLPA per l’analisi di metilazione specifiche per 25 geni oncosoppressori, 14 sonde di riferimento che non possono essere tagliate da HhaI, 41 sonde per l’analisi del numero di copie delle sequenze target e 9 frammenti di controllo che generano un prodotto di amplificazione più piccolo di 120 nt ( Q-fragment, D-fragment, X-fragment, Y-fragment) (Tabella 15).

Tabella 15: mix di sonde MS-MLPA utilizzate nel saggio di metilazione.

TRATTAMENTO DEL CAMPIONE

Il DNA genomico è stato estratto sia da fibroblasti wild-type sia da quelli trasdotti con il sistema d’immortalizzazione e mantenuti in coltura in presenza di Tetraciclina 400 ng/ml per numerosi passaggi, con il kit DNA extraction Wizard (Promega) e diluito in modo da ottenere una concentrazione di 50-100 ng di DNA in 5 ul di buffer di eluizione TE 0,1 (10 mM Tris-HCl pH 8.2 + 0,1 mM EDTA). Il valore di pH è importante per prevenire la depurinazione durante il trattamento iniziale a 98°C.

SCELTA DEI CAMPIONI DI CONTROLLO

In ogni test sono stati inclusi campioni di riferimento ottenuti da cellule wild-type non trattate. Il numero di copie delle sequenze e il loro profilo di metilazione sono stati considerati wild-type. Il controllo negativo è stato fatto sostituendo al DNA solamente il buffer TE per controllare la presenza di eventuali contaminanti.

In provette separate per PCR sono stati messi 5 ul di campione di DNA e dei relativi controlli. Queste sono state messe in un termociclizzatore e sottoposte al programma riportato in Tabella 16.

Svolgimento del test:

GIORNO 1

DNA DENATURATION

Il DNA è stato denaturato per 5 minuti a 98°C e poi raffreddato a 25°C prima di essere tolto dal macchinario (Tabella 16 punto1).

HYBRIDISATION REACTION

È stata preparata l’Hybridization master mix con 1,5 ul di buffer MLPA e 1,5 ul di probemix per ogni reazione. Dopo la denaturazione sono stati aggiunti 3 ul di l’Hybridization master mix in ogni provetta mescolando bene. Le reazioni sono state messe nuovamente nel termociclizzatore dove sono state incubate per 1 minuto a 95°C, poi 16-20 ore a 60°C per permettere l’annealing delle sonde ai ssDNA (Tabella 16 punto2).

GIORNO 2

LIGATION AND LIGATION-DIGESTION REACTION

È stata preparata la Ligase-65 master mix aggiungendo per ogni reazione 8,25 ul di acqua deionizzata + 1,5 ul di Ligase buffer B + 0,25 ul Ligase-65 enzyme mischiando senza vortexare. La Ligase-Digestion master mix è stata fatta con 7,75 ul di acqua dH2O + 1,5 ul di Ligase buffer B +

0,25 ul di Ligase-65 enzyme + 0,5 ul di enzima HhaI.

Dopo l’incubazione a 20°C, sono stati aggiunti 3 ul di Ligase buffer A e 10 ul di acqua in ogni provetta; dopo aver mescolato bene, sono stati trasferiti 10 ul di ogni mix in una seconda provetta. Una volta che il termociclizzatore ha raggiunto i 48°C alla metà dei tubini per il copy number test sono stati aggiunti 10 ul della Ligase-65 master mix, mentre a quelli per il methylation test sono stati aggiunti 10 ul della Ligase-Digestion mix. Le reazioni sono state incubate 30 minuti a 48°C per permettere la ligation e la digestione enzimatica. Gli enzimi sono stati inattivati a 98°C per 5 minuti e la reazione è stata raffreddata a 20°C prima di essere stata rimossa dallo strumento (Tabella 16 punto 3).

PCR REACTION

È stata svolta una reazione di PCR standard MLPS usando il Salsa MLPS® PCR Kit. È stata preparata la polymerase master mix con 3,75 ul di dH2O + 1 ul di SALSA PCR primer mix + 0,25 ul di SALSA

Polymerase per ogni reazione. Sono stati aggiunti 5 ul di polymerase mix per ogni tubino. Le condizioni di PCR sono riportate in Tabella 16 punto 4.

SEPARAZIONE DEI FRAMMENTI PER ELETTROFORESI CAPILLARE

Al termine della reazione di PCR, i campioni sono stati sottoposti a elettroforesi capillare secondo la reazione riportata in Tabella 17.

Tabella 17: condizioni per l’elettroforesi capillare specifiche per lo strumento Beckman.

I dati sono stati elaborati e analizzati dal software GeXP Software Package.