Il trasferimento di DNA esogeno all’interno di una cellula può essere fatto sfruttando i meccanismi d’infezione virali. I virus hanno evoluto strutture e meccanismi efficienti per l’infezione delle cellule e l’utilizzo del metabolismo cellulare per la loro replicazione. Le particelle virali, quindi, possono essere sfruttate come veicoli di materiale genetico ingegnerizzato dal momento che offrono sequenze e molecole che permettono l’espressione e in alcuni casi anche l’integrazione del DNA esogeno nel genoma della cellula. Negli anni sono stati sviluppati vettori per il trasferimento dei transgeni ad alta efficienza, modificati in base alle caratteristiche delle cellule da infettare. Il vettore virale è necessario che non contenga le sequenze utili al virus per la sua replicazione, che sono fornite separatamente, in modo da mantenere il sistema efficace e sicuro nell’utilizzo (Pistello M et al, 2012). La tecnologia del trasferimento genico avviene tramite trasduzione, la quale è definita come un’infezione non replicativa che permette all’informazione genetica eterologa di essere trasportata all’interno di un determinato tipo di cellula. Il numero di virus utilizzati per lo sviluppo di vettori e costantemente in aumento, ma, comunque, questi possono essere suddivisi in 5 categorie principali: vettori derivati da oncoretrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adeno-associati (AAV) e da HSV-1. Ciascuna categoria di vettori e caratterizzata da diverse proprieta che la possono rendere adatta per alcune applicazioni (Tabella 1).
Tabella 1: principali categorie di vettori virali e loro caratteristiche (Pistello M. in Principi di microbiologia medica. Antonelli G, Clementi M.,Pozzi G., Rossolini G.M., eds. Casa Editrice Ambrosiana, Milano.2012 Cap. 67, pag B-370).
3.3.1 VETTORI RETROVIRALI
I retrovirus sono dotati di envelope lipidico e capside proteico con genoma a RNA a singolo filamento in doppia copia con polarità positiva di 7-11 Kb. Dopo l’infezione delle cellule, l’RNA virale è retro trascritto in DNA e integrato nel genoma della cellula ospite. Alle estremità del materiale generico sono presenti le LTR (Long Terminal Repeat) che agiscono da promotori dei geni virali e nell’incapsidamento, retrotrascrizione e integrazione. Le LTR sono collocate in tandem con le open reading frame (ORF) gag (group specific antigen), pol (polimerasi) ed env (envelope) che codificano rispettivamente per le proteine strutturali, enzimatiche e per le glicoproteine di superficie. I geni necessari alla replicazione virale come gag (group specific antigen), pol
(polimerasi) ed env (envelope) possono essere tolti fornendo spazio per l’introduzione di sequenze transgeniche di lunghezza massima di 8 kb. I vettori retrovirali hanno la caratteristica di integrarsi stabilmente del genoma delle cellule target in modo da trasmettere il genoma esogeno alle generazioni successive. L’integrazione nel DNA cellulare richiede la disgregazione nucleare e per questo può avvenire soltanto durante la mitosi cellulare. La necessità di cellule in divisione rappresenta uno dei limiti nell’utilizzo dei retrovirus per la trasduzione.
3.3.2 VETTORI LENTIVIRALI
I lentivirus sono virus appartenenti alla famiglia dei retroviridae che hanno sviluppato un trasporto attivo del complesso di pre-integrazione che sfrutta il normale meccanismo d’importazione nel nucleo di sequenze della cellula target. Di conseguenza è possibile usare vettori di questo tipo per infettare cellule non proliferanti dal momento che non è richiesta la disgregazione nucleare. I primi vettori che sono stati sviluppati erano derivati da HIV-1, resi replicazione incompetenti. Inizialmente sono stati usati per trasdurre i linfociti T ma con l’utilizzo di VSV-G, glicoproteina G dell’envelope del virus della stomatite vescicolare, è stato possibile ampliare lo spettro d’ospite. Le particelle virali sono generalmente prodotte usando tre vettori (splitcomponent) con i quali sono forniti geni necessari alla produzione di tutte le parti del virus: il plasmide vettore dove sono state clonate le sequenze d’interesse e alle cui estremità di trovano le due LTR; il costrutto packaging che permette la retrotrascrizione e l’integrazione codificante per i geni virali gag e pol, il plasmide codificante le proteine dell’envelope. In questo modo i rischi associati a una possibile ricombinazione tra le componenti a livello di DNA sono ridotti. Tra tutti i lentivirus fino ad ora ingegnerizzati, quelli derivati da HIV-1 sono tra i più utilizzati.
4 SCOPO DELLA TESI
In questo lavoro di tesi è stato allestito un sistema di immortalizzazione innovativo ispirato all’articolo di Kendall et al. I sei oncogeni C-MYCT58A, hRASG12V, CDK4R24C, CCND1, hTERT e p53DD sono stati posti sotto il controllo di un promotore inducibile di terza generazione attivato da un transattivatore proteico e dall’antibiotico Tetraciclina, o dall’analogo Doxiciclina, secondo i sistemi Tet-On riportati in letteratura. Per la veicolazione e l’integrazione dei transgeni è stato scelto un vettore lentivirale derivato da HIV-1 invece dei retrovirus originariamente utilizzati, in modo da rendere il sistema applicabile anche a quei tipi cellulari che non hanno una capacità proliferativa elevata evitando la necessità della divisione cellulare.
Dagli esperimenti fatti dal gruppo di Kendall e collaboratori, è noto che gli oncogeni espressi costitutivamente sono in grado di avviare la trasformazione tumorale in cellule primarie normali derivate da tessuto. Lo scopo della tesi è stato quello di sviluppare un sistema d’immortalizzazione a espressione controllata e di valutarne gli effetti in base al livello di Tetraciclina utilizzato su cellule primarie, come fibroblasti derivati da biopsia di derma. A questo fine sono stati fatti test di caratterizzazione per capire se un’espressione genica inferiore a quella costitutiva, potesse permettere l’immortalizzazione cellulare senza trasformarle in modo irreversibile ma mantenendo le caratteristiche fenotipiche del tessuto di provenienza. Sono state analizzate le caratteristiche cellulari anche in seguito al blocco dell’espressione degli oncogeni interrompendo la somministrazione di Tetraciclina per valutare se le modificazioni causate dai transgeni possano essere reversibili.
La comprensione di questi processi, tramite l’utilizzo del sistema allestito, potrebbe essere di fondamentale importanza per la biologia di base come per lo studio della trasformazione tumorale controllata e il processo d’invecchiamento cellulare. L’applicazione potrebbe avere anche scopi commerciali come la creazione di linee immortalizzate ancora non in commercio e l’ottenimento di colture cellulari con una sopravvivenza maggiore personalizzate di cellule paziente-specifiche.
5 MATERIALI E METODI