Determinazione dei Composti Fenolici

Dai grappoli delle differenti uve, prima della vinificazione, sono stati recuperati 3 lotti composti ciascuno da 10 acini (3 repliche). I restanti acini sono stati congelati a -20 °C per eventuali ripetizioni. Gli acini di ciascun lotto sono stati pesati, separati in bucce, polpa e vinaccioli e sottoposti all’estrazione della componente fenolica secondo la metodica di Di Stefano et al. (1991).

Determinazione dei composti fenolici totali

Il contenuto fenolico totale dei vini è stato misurato utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile (Varian Cary 50 SCAN, Palo Alto, CA, USA) settato a 765 nm secondo il metodo di Folin-Ciocalteu come riportato da Singleton e Rossi (1965).

I risultati sono stati espressi come mg di acido gallico equivalente/L nel caso del succo/vino e come mg/kg di sostanza secca nel caso di bucce e vinaccioli.

Determinazione dei flavonoidi totali, delle proantocianidine e dei

flavani reattivi alla vanillina

L’analisi dei flavonoidi totali, delle proantocianidine e dei flavani reattivi alla vanillina è stata eseguita secondo il metodo di Di Stefano et al. (1991).

I risultati sono stati espressi in mg (+)-catechina/L, nel caso dei flavonoidi totali e dei flavani reattivi alla vanillina e in mg cianidina cloruro/L nel caso delle proantocianidine. Nel caso di bucce, polpe e vinaccioli i risultati sono stati espressi in mg (+)-catechina/kg di sostanza secca e in mg cianidina cloruro/kg di sostanza secca.

Determinazione degli acidi idrossi-cinnamil-tartarici

Per la determinazione degli acidi idrossi-cinnamil-tartarici è stata seguita la metodica di Di Stefano et al. (1991).

I risultati sono stati espressi in mg di acido caffeico/L. Nel caso di bucce, polpe e vinaccioli i risultati sono stati espressi in mg di acido caffeico/kg di sostanza secca.

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MATERIALI E METODI

Determinazione del profilo fenolico mediante HPLC-DAD

L’analisi del profilo fenolico è stata effettuata, nei primi due anni di dottorato, per i vini

Sauvignon blanc, Falanghina, Bombino bianco e Fiano passito, mediante cromatografia

liquida ad alta prestazione con rivelatore a matrice di diodi (HPLC-DAD) utilizzando lo stesso sistema cromatografico impiegato per la determinazione degli acidi organici. La separazione cromatografica, condotta secondo il metodo proposto da Revilla et al., (2000) opportunamente modificato, è stata effettuata iniettando il campione, previamente filtrato su filtri di nylon da 0,45 μm, in testa ad una colonna Zorbax SB- C18 (100 mm × 4,6 mm, 1,8 μm). È stata utilizzata come fase mobile, al flusso di 0,5 mL/min, una miscela costituita da acqua:acetonitrile (95:5 v/v) (solvente A) e da acqua:acetonitrile (50:50 v/v) (solvente B); entrambe le soluzioni di eluizione sono state portate ad un pH pari a 1,8 con acido perclorico.

La separazione è stata condotta secondo il seguente gradiente: da 95% A a 90% A in 4,8 min., a 80% A in 12 min., a 70% A in 4,8 min., a 60% A in 9,6 min., a 55% A in 9,6 min., a 0% A in 7,2 min., a 0% A per 10 min., a 95% A in 2 min. e a 95% A per 20 min. La rilevazione è stata effettuata alle seguenti lunghezze d’onda: 280 nm (acidi fenolici, catechine, proantocianidine, molecole polimeriche derivate da flavan-oli), 313 nm (acidi fenolici) e 350 nm (flavonoli glicosidici).

L’analisi quantitativa è stata effettuata mediante allestimento di rette di calibrazione a concentrazioni note di diversi standard puri ed esprimendo il risultato in mg/L e mg/kg (per bucce, polpe vinaccioli) di standard utilizzato.

L’identificazione dei composti fenolici è stata effettuata mediante il confronto degli spettri e dei tempi di ritenzione relativi (TRR) dei picchi dei campioni con quelli ottenuti iniettando i seguenti standard puri:acido gallico, acido 3,4 di-idrossibenzoico, 3,4di-idrossifenilacetico, protocatecualdeide, acido 4-idrossibenzoico, acido2,5- diidrossibenzoico, acido clorogenico, acido caffeico, acido siringico, acido ferulico, acido sinapico, acido O-cumarico, acido salicilico, acido trans-cinnamico, procianidina B1 e B2, catechina, epicatechina, rutina, acido caffeil-tartarico e resveratrolo, oltre che con quelli riportati in letteratura (Revilla et al., 2000).

Inoltre, l’identificazione dei composti fenolici è stata effettuata iniettando i campioni e gli standard puri in un sistema HPLC-DAD-ESI-MS/MS, dotato di un sistema di degasaggio mod. G1379A, una pompa binaria mod. G1376A, un auto campionatore mod. G1377A, un rilevatore a serie di diodi, mod. G1315C, e trappola ionica

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MATERIALI E METODI

MSDXCT-trap Plus mod. G2447A (Agilent, Santa Clara, CA,165 USA) accoppiato con una interfaccia ESI, utilizzata in modalità di ionizzazione sia positiva che negativa con un voltaggio capillare di 3500 V ed un voltaggio per lo skimmer di 40 V. La pressione di nebullizzazione è stata di 40 Psi ed il flusso di azoto è stato impostato a 10 L/min. La temperatura di essiccamento è stata impostata a 350 °C. L’intervallo di MS monitorato è stato da 100-800 m/z.

Determinazione del profilo fenolico mediante HPLC-DAD-ESI-

MS/MS.

Nel terzo anno di dottorato, il profilo fenolico dei vini Greco e Minutolo, è stato analizzato mediante il sistema HPLC-DAD-ESI-MS/MS, appena descritto, secondo il metodo proposto da Crupi et al. (2012) opportunamente modificato. È stata utilizzata una colonna a fase stazionaria inversa di tipo Poroshell 120 SB-C18 2.7 µm (150 × 2,1 mm di diametro interno, Agilent Technologies) termostatata a 40 °C. Il gradiente di acido formico all’1% in acqua (solvente A) e acetonitrile (solvente B) utilizzato è il seguente: a 0 min. 0% B, a 2 min. 5% B, a 10 min. 13% B, a 25 min.15% B, a 30 min. 22% B, a 50 min. 22% B, a 50 min. 22% B, a 55 min. 95% B, a 65 min. 95% B, a 66 min. 5% B.

A fine corsa, a 66 min., la colonna ha subito una fase di lavaggio e una di riequilibrazione. Il flusso è stato mantenuto a 200 µL/min.; il volume di campione iniettato è stato di 8 µL.

Il DAD è stato settato per la rivelazione tra 250 e 650 nm e l’assorbanza è stata registrata alle lunghezze d’onda di 280, 313 e 350 nm. La sorgente ESI è stata utilizzata in modalità sia positiva che negativa ed è stato utilizzato un voltaggio di capillare 3500 V ed un voltaggio per lo stimme di 40 V. La pressione di nebulizzazione è stata di 40 psi e il flusso di azoto è stato impostato a 8 L/min. La temperatura di essiccamento è stata impostata a 350 °C. L’intervallo di massa monitorata è stato da 50 a 1200 m/z. Prima dell’iniezione, il vino è stato filtrato con filtri a siringa in acetato di cellulosa (0,45 µm). L’identificazione dei composti è stata possibile effettuando una combinazione di informazioni quali:

 pattern di eluizione;  spettro MS e UV-vis;

 pattern di frammentazione MS/MS.  modelli strutturali ipotizzati in letteratura.

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MATERIALI E METODI

Le determinazioni quantitative sono state effettuate con un metodo a standard esterno utilizzando lo standard commerciale della (+)-catechina. La curva di calibrazione è stata ottenuta con l’iniezione di soluzioni a concentrazione nota dello standard puro, utilizzando gli stessi parametri di corsa dei campioni.