La diagnosi di IMHA procede attraverso una serie di prove di laboratorio, da eseguire dopo aver riscontrato un’anamnesi e dei segni clinici compatibili con la patologia14. Il test più semplice e vantaggioso nella diagnosi di IMHA è l’esame emocromocitometrico completo, comprendente anche la conta dei reticolociti13. Deve quindi essere raccolto un campione di sangue in EDTA da sottoporre all’esame ematologico automatizzato ed all’esame dello striscio, nonché al test di autoagglutinazione. In presenza di evidenze cliniche ed ematologiche compatibili con IMHA, la prova diagnostica definitiva consiste nell’identificazione degli anticorpi diretti verso la membrana eritrocitaria14.
Purtroppo, l'individuazione di forti indicatori di IMHA, come la sferocitosi, l'autoagglutinazione persistente e il risultato positivo del test di Coombs, non permette di distinguere la malattia primaria dalla quella secondaria. Come più volte sottolineato, la diagnosi di IMHA primaria può essere raggiunta solo escludendo la presenza di infezioni o neoplasie sottostanti e l’esposizione a tossine/farmaci. L'esclusione definitiva di una malattia infettiva o neoplastica sottostante può essere raggiunta solo mediante un'approfondita ricerca attraverso la diagnostica per immagini e i test per gli agenti infettivi. Questi sono particolarmente indicati nei pazienti che non rispondono alla terapia immunosoppressiva convenzionale e nei pazienti in cui il segnalamento suggerisce che una IMHA primaria sia improbabile (ad es. nei pazienti anziani) o che sia probabile una IMHA secondaria (ad es. in caso di evidenze di infestazione da zecche).
Nei cani che presentano un’anemia emolitica, comunque, è sempre indicata l’esecuzione di test sierologici e/o PCR per la ricerca di agenti infettivi emotropici (ad es. Ehrlichia spp.,
Bartonella spp., Babesia spp., Leptospira spp., Mycoplasma haemocanis e Anaplasma phagocytophilum) che possono innescare o mimare una IMHA. Sono inoltre consigliati il test
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4.1 – TEST DI AUTOAGGLUTINAZIONE
L’autoagglutinazione può essere testata direttamente facendo ruotare la provetta con il sangue in EDTA e osservando l’aggregazione cellulare sulla parete, oppure ponendo una goccia di sangue su un vetrino per l’osservazione al microscopio. L’agglutinazione può avvenire solo a 4°C (e non a temperatura ambiente o a 37°C), quindi il sangue da sottoporre a questa valutazione deve essere refrigerato14. La vera agglutinazione (aggregazione di eritrociti per la presenza di anticorpi anti-eritrociti sulla loro membrana) deve essere distinta dal rouleaux (conglomerati di eritrociti che si sviluppano per ragioni non immunologiche, soprattutto alle basse temperature). Il test di agglutinazione su vetrino in soluzione salina è utilizzato allo scopo di evitare questi risultati falsi positivi, in quanto la soluzione salina è in grado di interrompere la formazione di rouleaux ma non dell’aggregazione. Il rapporto tra soluzione salina ed eritrociti da utilizzare differisce tra i vari protocolli da 1:1 fino a 10:11,12,108. L’agglutinazione può anche essere visualizzata macroscopicamente su un vetrino, ma molti clinici preferiscono confermare l'assenza di aggregati mediante l’esame microscopico. La scomparsa degli aggregati eritrocitari in soluzione salina non esclude l’IMHA, in quanto i ripetuti lavaggi degli eritrociti possono rompere gli aggregati eritrocitari108. Un risultato positivo al test di agglutinazione salina è stato riportato nel 40- 89% dei cani con IMHA da numerosi studi5,7,11,39 ed è generalmente accettato come criterio patognomonico di IMHA1,12,108. Una persistente agglutinazione in seguito all’aggiunta di soluzione salina sembra essere inoltre correlata ad una elevata gravità della malattia e ad un alto tasso di mortalità13,77.
4.2 – ESAME MICROSCOPICO DELLO STRISCIO EMATICO
L’esame microscopico dello striscio di sangue riveste un’estrema importanza nella diagnosi dell’IMHA, in quanto fornisce informazioni in tempo reale sulla natura dell'anemia e, attraverso l'osservazione diretta della morfologia degli eritrociti, permette di rilevare anomalie che non possono essere rilevate da nessun altro test diagnostico109. L’esame dello striscio di sangue di un paziente con sintomi compatibili con IMHA dovrebbe evidenziare gli indicatori di rigenerazione degli eritrociti e le anomalie morfologiche tipiche della malattia.
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Come già più volte sottolineato, la presenza di segni di rigenerazione indica che il midollo osseo è in grado di rispondere all’anemia in maniera appropriata e che la probabile causa dell’anemia è la perdita di sangue o l’emolisi. I segni di rigenerazione che possono essere riscontrati tra i parametri dell’emocromo sono la macrocitosi (elevato MCV), l’ipocromasia (basso MCHC) e il volume cellulare eterogeneo (elevato RDW). Queste caratteristiche possono essere rilevate anche all’esame dello striscio ematico, in cui è possibile osservare cellule di dimensioni maggiori (macrocitosi), con aumentato pallore centrale (ipocromasia) e di volume diverso l’una dall’altra (anisocitosi). Segni di accelerata eritropoiesi che possono essere osservati nello striscio ematico sono anche gli eritrociti nucleati (metarubrociti e rubrociti) e i policromatofili (reticolociti)13.
Gli eritrociti nucleati (fig. 4.1) presentano una moderata/ridotta quantità di citoplasma di colore rosa-blu ed un nucleo rotondo, piccolo e picnotico, con cromatina fortemente addensata. La presenza di queste cellule eritroidi nucleate nel sangue periferico è indicata anche con il termine di “normoblastemia”. Gli eritrociti nucleati non sono normalmente presenti nel sangue periferico dei cani adulti sani, se non in percentuali molto basse, ma non è disponibile alcuna spiegazione circa il meccanismo che impedisce queste cellule di raggiungere la circolazione periferica. L'ipotesi più plausibile è che, probabilmente a causa della presenza del nucleo, gli eritrociti immaturi non siano sufficientemente deformabili da riuscire a passare l’endotelio dei seni del midollo osseo e raggiungere il lume dei vasi sanguigni. Pertanto, un elevato conteggio di eritrociti nucleati nel sangue periferico può indicare un danno a carico della barriera emato-midollare (probabilmente causato dall’ipossia) o, in alternativa, una ematopoiesi extramidollare che si è attivata in risposta all’anemia110,111. L’eritropoiesi compensatoria indotta dall’eritropoietina in corso di ipossia è stata riportata in pazienti umani con disturbi cardiopolmonari, come l’embolia polmonare, e può indicare una prognosi sfavorevole111. La normoblastemia è stata spesso riportata nei cani con IMHA, ma il suo valore prognostico in questi pazienti è ancora poco chiaro.
Gli eritrociti policromatofili (fig. 4.1) sono i reticolociti che, colorati con le metodiche routinarie di Romanowsky (May-Grunwald Giemsa, Wright e Diff-Quick), si presentano come cellule di dimensioni maggiori rispetto agli eritrociti e di colore bluastro94,112. Nei cani sani possono essere riscontrati occasionalmente, ma rappresentano meno dell’1% del totale delle cellule113. I reticolociti sono globuli rossi che sono stati rilasciati dal midollo osseo prima della completa estrusione dell’RNA e degli organelli cellulari. Per la loro corretta
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identificazione è necessario colorare lo striscio di sangue mediante colorazioni sopravitali come il Nuovo Blu di Metilene (NBM) o il Cresil Blu Brillante (CBB), che evidenziano debolmente il citoplasma ma forniscono informazioni circa la struttura nucleare e nucleolare. Queste colorazioni fanno anche precipitare l’RNA dei reticolociti, colorandolo di blu; di conseguenza, queste cellule appaiono con un citoplasma color grigio-verdastro chiaro cosparso di una fine trama reticolare o punteggiata più scura (fig. 4.2)94,113. Viene quindi contato il numero di reticolociti osservati per 1000 globuli rossi normali: un campo ad ingrandimento 40x in cui i globuli rossi si toccano contiene circa 200 cellule; quindi il numero di reticolociti contati in cinque di questi campi viene diviso per 10 per dare la percentuale di reticolociti (numero di reticolociti per 100 eritrociti normali)112. La conta reticolocitaria corretta in base al grado di anemia (CPR, Corrected Percentage Reticulocyte count) viene calcolata moltiplicando la percentuale dei reticolociti per il valore di Hct del paziente e dividendola per il valore normale di Hct nella specie (45% nel cane). Una percentuale di reticolociti al di sotto dell’1% corrisponde ad un’assenza di rigenerazione, una percentuale dell’1-4% ad una rigenerazione lieve, una percentuale del 5-20% ad una rigenerazione moderata ed una percentuale del 21-50% ad una rigenerazione marcata94. I reticolociti non sono generalmente osservati in circolo nei primi 2-4 giorni dall’evento emorragico o emolitico, in quanto la risposta rigenerativa richiede 3-5 giorni per manifestarsi. Nel cane, la risposta dei reticolociti generalmente ha un picco tra 4 e 7 giorni dall'insulto ed inizia a diminuire dopo 2-3 settimane se la causa dell'anemia è stata trattata. L’assenza di una risposta rigenerativa dopo 5 giorni suggerisce l’esistenza di una patologia midollare ed impone l’esecuzione di un aspirato e/o una biopsia del midollo osseo. La policromasia e la reticolocitosi sono quindi i tratti distintivi dell’anemia rigenerativa all’esame dello striscio e sono quindi riscontri tipici nell’IMHA89,112. I policromatofili e i reticolociti indicano un aumento del rilascio di cellule immature dal midollo osseo o da organi ematopoietici extramidollari86.
Anche i corpi di Howell-Jolly (fig. 4.1) sono un reperto frequente in corso di anemia rigenerativa. Essi rappresentano dei piccoli residui nucleari di forma rotonda che si trovano all’interno del citoplasma dei giovani eritrociti. Nel cane, al contrario di ciò che accade nel gatto e nel cavallo, non sono osservati in condizioni normali, perciò sono indicativi di un’aumentata produzione eritrocitaria o di una loro ridotta eliminazione da parte della milza per ipofunzionalità splenica o splenectomia94,96.
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Per quanto riguarda le alterazioni morfologiche eritrocitarie, quelle più frequentemente riportate nei pazienti con IMHA sono la sferocitosi e l’autoagglutinazione7,13,14,73,83. Gli sferociti (fig. 4.3) si formano come risultato della parziale rimozione, ad opera dei macrofagi, delle membrane eritrocitarie ricoperte da anticorpi, che porta alla perdita della normale forma discoidale degli eritrociti e alla riduzione del loro volume2. Sullo striscio di sangue, queste cellule appaiono leggermente più scure rispetto ai globuli rossi normali, non presentano il tipico pallore centrale e spesso risultano più piccole109. Poiché gli sferociti sono il risultato di un’attività fagocitaria sui globuli rossi, possono essere presenti anche in altre condizioni patologiche, come nella sindrome emofagocitica e nell’emolisi indotta dallo zinco, Figura 4.2 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, colorato con NBM ed osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare i reticolociti (freccia), con la loro trama reticolare o punteggiata più scura rispetto al citoplasma.
Figura 4.1 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare un eritrocita nucleato (freccia rossa), un policromatofilo (freccia blu) e due corpi di Howell-Jolly (freccia verde).
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sebbene in numero inferiore rispetto all’IMHA (1+ contro 2+)2. Sono stati inoltre associati all’avvelenamento da morso di serpente o da puntura d’ape nel cane41,114 e sono stati riportati in un Basenji con carenza di piruvato chinasi115. Infine, gli sferociti possono essere causati anche da un difetto molecolare in una o più delle proteine del citoscheletro degli eritrociti (ad es. spettrina)109,116. Pur non essendo patognomonici, comunque, gli sferociti sono fortemente indicativi di IMHA nel cane, soprattutto se presenti in numero significativo (2+ o superiore) e se associati all’autoagglutinazione8,13,14,112. In vari studi retrospettivi, il 90% circa dei cani con IMHA presentava sferociti nello striscio ematico, benché nel cane con emolisi iperacuta possano essere in numero scarso2.
Altre cellule anormali che possono essere riscontrate sono le cellule fantasma (fig. 4.4), che rappresentano residui della membrana degli eritrociti che hanno subìto lisi intravascolare. Tuttavia, dato che la lisi può avere sia origine immunomediata che non immunomediata, le cellule fantasma non sono diagnostiche di IMHA2.
Figura 4.3 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare gli sferociti (frecce), che risultano più piccoli rispetto agli eritrociti normali e non presentano il tipico pallore centrale.
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Infine, un’alterazione morfologica che può essere presente in corso di IMHA è rappresentata dagli schistociti (noti anche come “schizociti” o “frammentociti”). Gli schistociti (fig. 4.5) sono eritrociti frammentati, derivanti in genere da danni meccanici secondari ad anomalie vascolari o a turbolenze del flusso ematico. La forma di questi frammenti può variare da appuntita a triangolare a spiculata. La frammentazione microangiopatica dei globuli rossi è stata descritta in cani affetti da svariati disturbi, tra cui coagulazione intravascolare disseminata, glomerulonefrite, emangiosarcoma, mielofibrosi, diseritropoiesi e tossicosi cronica da doxorubicina94,109,117–119. La presenza di frammenti di globuli rossi nel sangue dei cani affetti da IMHA può quindi essere dovuta allo sviluppo di CID, che è una complicazione comune della malattia; tuttavia, l'applicazione clinica di questa osservazione e la sua correlazione con la CID o con il tromboembolismo polmonare è ancora da definire.
Figura 4.4 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare una cellula fantasma (freccia), che rappresenta un residuo della membrana eritrocitaria in corso di emolisi intravasale.
Figura 4.5 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare uno schistocita (freccia), derivante dalla frammentazione di un eritrocita in corso di fagocitosi extravasale.
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Per quanto riguarda la serie bianca, all’esame dello striscio è possibile riscontrare neutrofili immaturi13–15,93 e, talvolta, anche neutrofili tossici93,120 e linfociti reattivi121.
La presenza di neutrofili immaturi (figg. 4.6 e 4.7) deriva da un aumentato tasso di rilascio di neutrofili dal midollo, con impoverimento delle riserve di neutrofili segmentati e conseguente rilascio delle cellule immature in circolo (left shift). Principalmente si ha il rilascio di neutrofili banda ma, nelle situazioni più gravi, si possono riscontrare in circolo anche cellule più immature, come metamielociti e mielociti92.
Figura 4.6 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare un neutrofilo banda (freccia), con il tipico nucleo a ferro di cavallo. È inoltre possibile notare la microagglutinazione degli eritrociti circostanti.
Figura 4.7 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare un neutrofilo banda (freccia rossa) e un metamielocita (freccia blu).
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La tossicità neutrofilica (fig. 4.8) può essere associata a qualsiasi malattia infiammatoria abbastanza grave da provocare una accelerata produzione di neutrofili, con riduzione della loro maturazione nel midollo. I neutrofili tossici possono essere caratterizzati da basofilia citoplasmatica, vacuolizzazione citoplasmatica, corpi di Dohle e granulazioni tossiche92. La presenza di neutrofili tossici è stata segnalata in alcune malattie non infettive, tra cui l’IMHA canina120,121.
I linfociti reattivi (fig. 4.9) possono essere riscontrati nel sangue periferico in caso di prolungata stimolazione antigenica (ad es. infezioni, vaccinazioni). Essi sono di dimensioni maggiori rispetto agli altri linfociti e presentano un citoplasma intensamente basofilo, una zona di Golgi pallida e/o fini vacuoli citoplasmatici ed un nucleo con cromatina addensata92. La reattività linfocitaria è considerata un segno di forte stimolazione immunitaria, attribuita principalmente alle malattie virali e croniche, ma anche alle malattie autoimmuni121.
Figura 4.8 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV. È possibile notare un neutrofilo tossico (freccia), con vacuoli citoplasmatici e granulazioni tossiche.
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Infine, per quanto riguarda la morfologia piastrinica, negli strisci ematici dei soggetti con IMHA è possibile riscontrare la presenza di macropiastrine e di piastrine attivate.
Le macropiastrine (fig. 4.10) sono piastrine di dimensioni pari o superiori a quelle degli eritrociti e suggeriscono un’attiva trombopoiesi o la presenza di un disordine mieloproliferativo o mielodisplastico94,122. Nei soggetti affetti da IMHA, le macropiastrine rappresentano una popolazione giovane di piastrine che è stata mobilizzata di recente dal midollo osseo. Le giovani piastrine, oltre ad essere di dimensioni maggiori, sono più attive metabolicamente e funzionalmente, e normalmente sono sequestrate nella milza81. Un'altra ipotesi che può spiegare la presenza delle macropiastrine è l'attivazione di un meccanismo ematopoietico extramidollare che causa il rilascio di questi elementi cellulari immaturi dal tessuto emopoietico111,123,124. È inoltre stato suggerito che, nei cani colpiti da IMHA, la contrazione della milza (associata all’anemia o alla somministrazione di corticosteroidi) potrebbe ridurre il sequestro delle piastrine e permettere ai giovani elementi cellulari di circolare. Indipendentemente dalla causa, la presenza di macropiastrine, insieme alla presenza di piastrine attivate, contribuisce allo sviluppo di uno stato protrombotico nei cani con IMHA81.
Figura 4.9 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare un linfocita reattivo (freccia), con vacuoli citoplasmatici e cromatina nucleare addensata.
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Le piastrine attivate (fig. 4.11), all’esame dello striscio, appaiono come piastrine di forma sferica con sottili processi citoplasmatici protrudenti94. Tuttavia, per rilevare l’effettiva attivazione piastrinica, è necessaria una valutazione dell’espressione della P-selectina sulla membrana cellulare mediante citometria di flusso81,83.
Eritrociti nucleati, neutrofili banda e macropiastrine sono stati osservati, sia nell’uomo che nel cane, in corso di attivazione dell’ematopoiesi extramidollare111,123,124, ma la loro effettiva correlazione non è ancora stata dimostrata e necessiterebbe dell’agoaspirazione splenica, procedura non raccomandabile in pazienti critici come quelli affetti da IMHA.
Figura 4.10 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare una piastrina di dimensioni normali (freccia blu) e una macropiastrina (freccia rossa).
Figura 4.11 Striscio di sangue
periferico di un cane affetto da IMHA, osservato ad un ingrandimento 100X (ad immersione), presso il Laboratorio di Patologia Clinica dell’ODV.
È possibile notare una piastrina di dimensioni normali (freccia blu) e una macropiastrina (freccia rossa).
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4.3 – TEST DI COOMBS
Il test di Coombs, noto anche come test dell’antiglobulina, viene utilizzato per rilevare anticorpi e complemento sulla superficie dei globuli rossi. Gli anticorpi diretti contro la superficie dei globuli rossi sono spesso anticorpi incompleti, che sensibilizzano o ricoprono i globuli rossi ma non riescono a farli agglutinare senza l’aggiunta di potenziatori in grado di alterare il potenziale zeta dei globuli rossi o senza l'aggiunta del reagente antiglobulina. Molti anticorpi incompleti sono IgG e sono quindi rilevati da un siero anti-IgG (contenuto nel reagente antiglobulina); tuttavia, anche alcuni anticorpi IgM possono essere incompleti. Questi anticorpi incompleti producono un'attivazione del complemento anticorpo- dipendente; quindi i reagenti antiglobulina sono progettati per reagire anche con i componenti del complemento presenti sulla superficie dei globuli rossi, tra cui quelli principalmente rilevati sono il C4 e il C3. I reagenti polispecifici per uso veterinario sono solitamente anti-IgG, anti-IgM e anti-C3; sono inoltre disponibili reagenti monospecifici. In medicina veterinaria sono utilizzati due tipi di test di Coombs: il test diretto (DAT, Direct Antiglobulin Test) e il test indiretto (IAT, Indirect Antiglobulin Test). Il DAT, che rileva le immunoglobuline e/o il complemento che si trovano legati direttamente all’eritrocita, viene impiegato nella diagnosi dell’IMHA, mentre l’IAT, che rileva la presenza di anticorpi circolanti nel siero,non è considerato valido in medicina veterinaria a causa della bassa prevalenza di anticorpi non legati agli eritrociti125. Nel DAT, una sospensione di eritrociti lavati del paziente, legati in vivo ad immunoglobuline e/o complemento, viene incubata con un reagente antiglobulina, che si lega ai suddetti reagenti immunitari formando un reticolo che appare macroscopicamente come una agglutinazione dei globuli rossi (fig. 4.12)14.
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Il test antiglobulina può anche essere eseguito utilizzando piastre da microdiluizione, che consentono un maggior numero di diluizioni del reagente antiglobulina e utilizzano piccoli volumi di reagente e di globuli rossi per pozzetto. L'uso di più diluizioni ha dimostrato aumentare la sensibilità del test126.
Il test dell'antiglobulina diretto è, ad oggi, il test più comunemente usato in medicina veterinaria per la diagnosi di IMHA13,14,83,127,128. Tuttavia, esso è poco sensibile e nella migliore delle ipotesi fornisce solo informazioni semi-quantitative sul grado di legame degli anticorpi agli eritrociti128–130. I fattori che possono ridurre la sensibilità del test e causare risultati falsi negativi includono: l’insufficiente quantità di anticorpi o di complemento sugli eritrociti, l’inadeguato rapporto antiglobulina/anticorpo, il mancato incorporamento del reagente nel test (che provoca una risposta immunitaria cross-reattiva al complesso reagente-globuli rossi), un precedente trattamento con corticosteroidi di durata superiore ad una settimana e le temperature improprie o calde che disperdono le agglutinine fredde127,129,131,132. Inoltre, la performance diagnostica del test dipende da molti fattori,
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come l'uso di un reagente polispecifico invece di uno monospecifico, l’uso di una sola provetta invece di piastre da microdiluizione e un'unica incubazione a 37°C invece di una ulteriore incubazione a 4°C 125. Studi recenti hanno dimostrato che, quando la prova viene eseguita utilizzando soltanto reagenti polivalenti a 37°C, una percentuale di cani con IMHA risulta falsamente Coombs-negativa126,133. Un test di Coombs completo viene eseguito utilizzando un reagente polivalente (che riconosce IgG, IgM e C3 del complemento), ma