DIAGNOSI DI LABORATORIO

a) ISOLAMENTO ED IDENTIFICAZIONE DEL MICRORGANISMO a.1) ISOLAMENTO E MORFOLOGIA DELLE COLONIE

R. equi cresce se incubato in condizioni di aerobiosi a 37°C su

medium non selettivo usato normalmente nei laboratori di microbiologia. A 24 ore di incubazione, le colonie hanno il diametro di 1-2 mm e non sono caratteristiche. Dopo le 48 ore di incubazione su mezzi non selettivi, come l’agar sangue Trypticase soy, si sviluppano gli aspetti caratteristici (fig. 2): colonie a lacrima, irregolarmente tonde, lisce, semitrasparenti, lucenti, unite, mucoidi con bordi interi. Le colonie variano dai 2 ai 4 mm, sebbene colonie unite possano sembrare più grandi.

FIG. 2. Coltura di R. Equi in agar trypticase soia con 5% di sangue bovino dopo 48 ore a 37°C. La fotografia mostra il tipico aspetto a lacrima mucoide del batterio a quel tempo e la tipica variazione di colonia.

L’organismo non cresce sui molti tipi di agar MacConkey. Rari isolati di R. equi possono crescere a meno di 37°C (Muller et al.,

1988).

Varietà nelle colonie è riscontrabile nelle colture fresche. Il tipo classico coalescente, viscoso-mucoide è quello predominante, ma sono state viste anche forme meno mucoidi. E’ anche presente una piccola proporzione di piccole colonie non mucoidi di 1 mm o meno.

Oltre alla variazione delle colonie all’interno del ceppo, sono stati descritti quattro tipi stabili di colonia: mucoide classica, non mucoide, dissociata, piccola non mucoide (Mutimer et al., 1981). Le colture possono avere un lieve odore terroso.

La produzione di pigmento è riscontrata raramente in colture vecchie di circa 4 giorni (Barton et al., 1980) e sorprende questo aspetto dal momento che tutti i Rodococci (red-pigmented cocci) mostrano, ovviamente, colonie rosa o rosse subito appena isolate..

Dopo 4 o 7 giorni su mezzo non selettivo, come l’agar sanque Trypticase soy, le colonie possono sviluppare una lieve ombratura rosa salmone, anche se possono essere del tutto non pigmentate o apparire lievemente gialline (Barton et al., 1980). Forse la miglior descrizione del colore tipico delle colonia su agar sangue è una leggera colorazione fulvo chiaro. Colture mantenute in brodi per periodi prolungati senza subculture di solito divengono asciutte e di

colore arancio-rosso, ma ritornano all’aspetto normale nelle subculture (Karlson et al., 1940; Williams et al., 1971). La morfologia macroscopica della coltura del tipo ATCC 6939 (Magnusson, 1923), è più piccola di quella normale, liscia e asciutta (piuttosto che mucoide) e appare più colorata di quelle tipiche del

R. equi.

a.2) MORFOLOGIA MICROSCOPICA E PROPRIETA’ DI COLORAZIONE

R. equi è un coccobacillo pleomorfo e G+, che muta forma da

coccoide a bacillare a seconda delle condizioni di crescita. Di solito è coccoide, sia sui mezzi solidi che sul materiale purulento prelevato dai pazienti, ma in mezzo liquido, in particolare in colture giovani, forma lunghe aste o corti filamenti che possono mostrare una ramificazione rudimentale. I rapporti occasionali per cui R. equi è acido-resistente nella colorazione di Ziehl-Neelsen, sembrano dipendere dalla tecnica di colorazione, dall’età avanzata delle colture e dal mezzo di crescita (Jensen, 1934; Verge et al., 1942;

Barton et al., 1980). La maggior parte delle prove non sono riuscite

a dimostrare l’acido-resistenza. Sono stati descritti occasionali granuli metacromatici (Magnusson, 1923/1938; Karlson et al.,

1940), ma , così come la colorazione, non sono caratterizzanti, in

quanto dipendono dal mezzo e dalla colorazione stessa.

a.3) IDENTIFICAZIONE DELLE CARATTERISTICHE BIOCHIMICHE

Le caratteristiche che possono essere usate di routine nei laboratori clinici-microbiologici per identificare R. equi sono elencate nella tabella 3.

TABELLA 3. CARATTERISTICHE BIOCHIMICHE PER L’IDENTIFICAZIONE DI R. EQUI

CARATTERISTICA REAZIONE %

POSITIVA BIBLIOGRAFIA

CATALASI + 100

CITOCROMO C OSSIDASI - 1-5 Prescott, 1982

FERMENTAZIONE

CARBOIDRATI - 100

FERMENTAZIONE ALCOLICA - 100

IDROLISI DELLA GELATINA - 100

INDOLO - 100

H2S VARIABILE 32-62 Mutimer et al., 1981, Prescott,

1982

UREASI + 95 Mutimer et al., 1981, Prescott,

1982

IDROLISI IPPURATE - 1 Prescott, 1982

IDROLISI ESCULINA - 4 Prescott, 1982

RIDUZIONE NITRATI + 88 Mutimer et al., 1981

“EQUI FACTORS” + 100 Fraser G., 1964, Prescott, 1982

LIPASI + 100 Mutimer et al., 1983

FOSFATASI + 100 Mutimer et al., 1983

L’organismo è generalmente inerte da un punto di vista biochimico. Non ossida né fermenta alcun carboidrato o alcoli e non è proteolitico. Tramite cromatografia gas-liquida non si evidenziano prodotti metabolici acidi dal glucosio (Reddy et al., 1978). E’ catalasi positivo, quasi sempre ureasi positivo ed ossidasi negativo.

R. equi produce “equi factors” che interagiscono con la

fosfolipasi D del Corynebacterium pseudotubercolosis, con la beta tossina di S. aureus e con un’emolisina parzialmente caratterizzata di L. monocitogenes dando un area di completa emolisi con eritrociti di pecora o bovino (fig. 3) (Fraser, 1964, Prescott, 1982).

FIG. 3. dimostrazione della produzione degli ““equi factors””, che sono un’utile caratteristica identificativa di R. equi. Il batterio è stato strisciato verticalmente a sinistra e destra sulla piastra. La striscia superiore orizzontale è una coltura di Corynebacterium pseudotubercolosis e quella più bassa è una beta- tossina prodotta da S. aureus. Il lato sinistro is a 48-h growth of the isolates; right-hand side is a 24-h growth.

Mentre questa caratteristica non è unica per R. equi, è distintiva per questo organismo e può essere sempre usata nella sua identificazione, dato che non sono mai stati descritti isolati di

R. equi “equi factors” negativi.

R. equi produce lipasi e fosfatasi, ma non DNasi, elastasi,

lecitinasi o proteasi (Mutimer et al., 1983). L’API ZYM (Analytab Products Inc., Plainview, N.Y.) ha creato validi profili enzimatici distintivi per l’identificazione di R. equi (Mutimer et al., 1982). Tutti gli isolati testati sono risultati positivi per leucina arylamidasi, fosfatasi acida e fosfamidasi; il 90 % positivo per amilamidasi valina, lipasi esterasi e alfa-glucosidasi.

a.4) ALTRE CARATTERISTICHE IDENTIFICATIVE

Il batterio cresce in un ampio range di temperature che vanno dai 10°C ai 40°C. Sebbene ancora non accertata, la temperatura ottimale sembra essere di 30°C, ma la crescita è solo minimamente diminuita a 37°C (Hughes et al., 1987). Le colture crescono bene a temperatura ambiente così come a 37°C (Magnusson, 1938).

R. equi è un aerobio obbligato con semplici requisiti di crescita (GoodfelHow, 1986). Può utilizzare il carbonio prelevandolo da un’ampia varietà di fonti di carbonio del suolo, come gli acidi piruvico, acetico, butirrico e propionico (Yager, 1987) e l’azoto dall’ammonio solfato o dal potassio nitrato (Pradip et al., 1966).

L’organismo è immobile, aflagellato e può avere un basso numero di pili (Yanagawa et al., 1976). Cresce prontamente in brodi non selettivi, producendo generalmente una torpidità moderata, qualche volta con un sedimento leggermente rosa- salmone dopo 48 ore (Karlson et al.., 1940). Alcuni ceppi possono produrre una patina sottile che viene prontamente distrutta (Barton

La sensibilità antimicrobica ai farmaci, discussa oltre, è consistente e può essere un utile aggiunta nell’identificazione.

Le caratteristiche elettroforetiche delle preparazioni di cellule intere in gel di poliacrilamide sono già state descritte (Chirino-

Trejo et al., 1987).

Ulteriori caratteristiche di R. equi, che non possono essere determinate rapidamente nella routine clinica-microbiologica di laboratorio ma che sono usate nella classificazione tassonomica, sono state descritte precedentemente (vedi Tassonomia).

a.5) SIEROTIPI CAPSULARI

R. equi possiede una capsula polisaccaridica, lamellare, distinta e antigenicamente variabile (Woolcock et al., 1978), che è alla base del sistema di sierotipizzazione capsulare (Nakazawa et

al., 1983). Sono stati identificati almeno 27 differenti sierotipi

capsulari (Prescott, 1981; Nakazawa et al., 1983), dei quali il sierotipo capsulare Prescott 1 (o il suo equivalente in altri elenchi) è il più comune e diffuso nel mondo (Prescott, 1981; Mutimer et

al., 1982; Nakazawa et al., 1983; Kaura et al., 1987). Non c’è una

relazione apparente tra il sierotipo e la virulenza. b) PROCEDURE DIAGNOSTICHE

L’isolamento di R. equi dal sito di infezione è il miglior metodo diagnostico. Nell’uomo con malattie polmonari, l’espettorato è spesso, ma non sempre, un campione utile (Golub

et al., 1967; Marsch et al., 1973). La diagnosi è più realizzabile

tramite lavaggio bronchiale, l’aspirazione toracica percutanea o la biopsia del polmone dopo lobectomia (metodo decisamente drastico) (Savdie et al., 1977; Butler et al., 1986; Haglund et al.,

1989). In un’occasione il lavaggio bronchiale in pazienti umani non

è stato in grado di raccogliere R. equi (Savdie et al., 1977). Il fallimento supporta le scoperte di Martens et al. in colture di

secrezioni bronchiali ottenute dall’aspirazione transtracheale in puledri infettati sperimentalmente che non contenevano in quantità consistente il batterio (Martens et al., 1982). Hanno attribuito questo dato o alla diffusione periodica nell’aria o all’impossibilità di isolare tramite tecniche di colture standard i batteri all’interno dei fagociti. Anche se la maggior parte delle colture positive di puledri con polmonite da R. equi sono colture pure dell’organismo dall’aspirato polmonare, più di un terzo possono anche contenere una varietà di patogeni opportunisti (Falcon et al., 1985).

Quindi, R. equi può essere presente in colture miste e può essere ignorato come “difteroide” (Novak et al., 1988), in parte perché non mostra la dimensione distintiva delle colonie e l’aspetto mucoide prima delle 48 ore di incubazione. Colture di sangue da pazienti umani con la febbre e malattie polmonari hanno mostrato

R. equi (qualche volta ripetutamente) in circa un terzo dei casi

riportati (Berg et al., 1977; Fierer et al., 1986 ). Un numero di studiosi ha cercato approcci immunologici alternativi per la diagnosi nei puledri, ma nessuno di questi può sostituire quello colturale. Nei pazienti umani immunosoppressi, inclusi quelli con l’AIDS, i test immunologici non sono risultati affidabili per la diagnosi (Emersole et al., 1988). In puledri di meno di due mesi di età il test di linfoblastogenesi in vitro con linfociti del sangue periferico e antigeni di R. equi è in grado di distinguere i puledri malati da quelli sani (Prescott et al., 1980). Lo stesso test non è risultato di utilità in soggetti di oltre due mesi perchè la risposta dei cavali adulti o puledri sani veniva superata da quelli malati.

Una sinergica inibizione dell’emolisi per gli anticorpi degli “equi factors” distingue i puledri naturalmente affetti da rodococcosi rispetto a quelli sani, anche se non serve ad identificare i malati nei primi stadi della malattia sperimentalmente indotta (Prescott et al., 1984). Il test di immunoprecipitazione in gel di agar (AGID) per gli anticorpi degli “equi factors” identifica

anche i puledri con polmonite da R. equi, sebbene alcuni soggetti apparentemente sani siano risultati positivi (Nakazawa et al.,

1987). Usando test più sensibili per l’inibizione dell’emolisi e per

l’immunoprecipitazione descritti prima, Skalka ha dimostrato la capacità di difffusione della malattia nell’infezione subclinica spontanea o sperimentale da R. equi nei puledri (Skalka et al.,

1984/1985; Skalka, 1987).

In generale, il metodo ELISA viene usato per distinguere i puledri infetti da quelli sani (Takai et al., 1985). In uno studio, un estratto Tween 20 del ceppo ATCC 6939 ha dato la maggiore reattività crociata dei sierotipi testati (Takai et al., 1985). I valori medi delle IgG anti-R. equi nei puledri malati o sospetti tali sono risultati notevolmente più alti rispetto ai puledri normali nel ristretto gruppo di animali testati, ma non ci sono state differenze nei valori delle IgM e IgA (Takai et al., 1985/1986).

Il test ELISA risulta molto più sensibile rispetto al test di AGID o a quello dell’emoagglutinazione indiretta (Takai et al.,

1985). In due studi indipendenti in cui sono stati usati differenti

antigeni, non è stata trovata la correlazione tra i livelli delle immunoglobuline e la malattia clinica (Elienberger et al., 1984;

Hietala et al., 1985). Gli antigeni usati nell’ELISA sono importanti

per determinare il loro valore nella diagnosi sierologia (Takai et al.,

1985). Il surnatante delle cellule autoclavate o di quelle

omogeneizzate è relativamente povero di antigeni se confrontato con l’estratto Tween 20 o di materiali sunicati (vuol dire distrutti con gli ultrasuoni) (Takai et al., 1985).

Takai et al. (Takai et al., 1986) hanno quantificato R. equi fecale per determinare quali puledri avrebbero sviluppato febbre, tosse e diarrea. Usando un mezzo selettivo, hanno scoperto che quando i puledri si ammalano, il numero di R. equi fecale sale da livelli basali di circa 104_{/g a ≥10}7_{/g (Takai et al., 1986).}

Nella pratica clinica rivestono importanza analisi di laboratorio aspecifiche come la leucocitosi e la fibrinogenemia. I rilievi ottenuti con questa valutazione sono di tipo deduttivo e devono essere considerati criticamente. In un’indagine (Giguere et al., 2003), eseguita in Florida su 162 puledri di un allevamento con infezione enzootica, sono stati determinati i valori di cut off per i leucociti in un range di 13-15 x 103/ml, e per la fibrinogemia i valori

compresi tra i 500 e i 600 mg/dl.

5.2.9. TRATTAMENTO E CONTROLLO