PARTE SPECIALE
STAZIONE ESTREMITA’ FLACCIDE, SDRAIATO
1.2. ANALISI IMMUNOISTOCHIMICHE
1.3.1. RISULTATI BAL
La valutazione microscopica dei preparati ha previsto:
a) Valutazione morfologica di ogni caso, con determinazione della tipologia del processo patologico in atto e, in caso di flogosi, la caratterizzazione del tipo di essudato; per la valutazione della percentuale di macrofagi – cellule epitelioidi ci si è avvalsi anche dell’ausilio delle indagini immunoistochimiche effettuate tramite uso di anticorpo anti-lisozima.
b) Valutazione immunoistochimica: per la valutazione dei risultati immunoistochimici, inerenti l’espressione di antigene rodococcico in sede intramacrofagica; ogni striscio è stato valutato a 40X, per ogni striscio sono stati valutati 10 campi microscopici scelti in modo “random” e la media aritmetica dei valori di cellule positive ottenuti è stata ritenuta come l’espressione media di cellule positive per quel determinato striscio-puledro.
L’esame morfologico tramite colorazione con Ematossilina-Eosina (H&E) e tramite metodo Papanicolaou (PAP) ha permesso di confermare e classificare dal punto di vista citopatologico le differenti tipologie di flogosi, in base alle caratteristiche citologiche dell’essudato.
Nella tabella 8 vengono riportati i tre casi osservati, suddivisi per tipo di flogosi.
TABELLA 8: VALUTAZIONE CITOLOGICA ED IMMUNOISTOCHIMICA DEI TRE BAL E CARATTERIZZAZIONE MACROFAGICA.
Puledro Tipologie cellulari Macrofagi * Cellule
giganti* Diagnosi) Positività per R.equi
Puledro A Polimorfonucleati (+++)
Macrofagi (+++) Cellule epiteliali con
cilioftoria e degenerazione palloniforme (++) Siderociti (++) Eosinofili (++) Mastociti (+) Cellule di contaminazione orofaringea (-) Spirali di Curshmann (++) Linfociti (+++) Plasmacellule (++) 10.7 3.7 Bronco-bronchiolite cronica di tipo piogranulomatoso con numerose cellule giganti a caratterizzare l’essudato. Positivo: positività presente nelle cellule giganti ed in qualche macrofago. Puledro B Polimorfonucleati (+++) Macrofagi (+)
Cellule epiteliali con
cilioftoria e degenerazione palloniforme (+) Siderociti (+++) Eosinofili (+) Mastociti (-) Cellule di contaminazione orofaringea (-) Spirali di Curshmann (-) Linfociti (+) Plasmacellule (-) 4.2 1 Quadro di “Small airway inflammatory disease” SAID con atteggiamento cronicizzate.
Negativo
Puledro C Polimorfonucleati (+) Macrofagi (+)
Cellule epiteliali con
cilioftoria e degen.palloniforme(- /+) Siderociti (+++) Eosinofili (+) Mastociti (-) Cellule di contaminazione orofaringea (+) Spirali di Curshmann (-) Linfociti (+) Plasmacellule (-) 3.5 0.25 Quadro riferibile a probabile forma iniziale di flogosi a frigore, con EIPHD (Exercise induced pulmonary
haemorrage disease).
Negativo
• Numero medio di cellule Lisozima + per campo a 40X, contato su 10 campi scelti randfom.
In tutti e tre i casi analizzati si è potuta constatare la presenza di un processo infiammatorio a carico delle vie aeree profonde. In particolare, mentre nel puledro C i reperti citologici hanno indicato un
processo in fase iniziale (modica presenza di polimorfonucleati, scarsità di macrofagi alveolari desquamanti e caratteristiche reologiche del muco, oltrechè presenza di contaminazione di cellule del tratto orofaringeo - Fig.11) con sovrapposizione di microemorragie polmonari (presenza di siderociti e globuli rossi “vecchi” sul fondo del campione), il puledro B ha mostrato un pattern citologico riferibile ad una SAID ad eziologia non specifica (Fig.12). La condizione di SAID, in base alla presenza di alcune cellule giganti e un buon numero medio di macrofagi, è apparsa quindi in fase cronicizzate. Il puledro A ha invece mostrato un pattern citologico tipico di flogosi cronica, caratterizzato, oltrechè dal numero di neutrofili ma soprattutto di macrofagi presenti (Fig. 13), dalle mutate caratteristiche reologiche del muco, estrinsecatesi nella comparsa di spirali di Curshmann (Fig. 14) e da una elevata atipia delle cellule epiteliali, talora polinucleate (Fig. 15). La presenza di numerose cellule giganti (Fig. 16) ha permesso di classificare la flogosi come piogranulomatosa; molte di queste cellule giganti così come alcuni macrofagi sono risultati positivi alla reazione con anticorpo mononclonale contro R.equi (Fig. 17, 18 e 19).
Fig. 12. Puledro B; ampia presenza di neutrofili ed eosinofili caratterizzanti il BAL. PAP 20X.
Fig. 13. Puledro A; macrofagi con articolato citoplasmatico e neutrofili; si noti la filamentosità del muco. PAP 20X.
Fig. 14. Puledro A; caratteristica spirale di muco, indice di mutate caratteristiche reologiche del medesimo. PAP 20X.
Fig. 15. Puledro A; cellula gigante di ragguardevoli dimensioni; si noti la caratteristica disposizione dei nuclei e la presenza di strutture coccoidi intracitoplasmatiche. PAP 60X.
Fig. 16. Puledro A; gruppo di cellule epiteliali ciliate desquamate; si noti la notevole anisocitosi e la cilioftoria di alcune di esse. Sullo sfondo è sempre osservabile la presenza di strie di muco e neutrofili a nucleo picnotico. PAP 40X.
Fig. 17. Puledro A; due cellule giganti con debole positività citoplasmatica per Rhodococcus
Fig. 18. Puledro A; Cellula gigante fortemente positiva per Rhodococcus equi. IHC 20X.
Fig. 19. Puledro A; Cellula gigante fortemente positiva per Rhodococcus equi; si noti la positività di fondo dell’area dello striscio, con alcuni macrofagi ugualmente positivi. IHC 40X.
CONCLUSIONI
Nonostante alcune difficoltà materiali, questo studio è stato portato avanti per due stagioni riproduttive consecutive, permettendo di raccogliere i dati sufficienti per caratterizzare un campione abbastanza significativo di soggetti. Questo ha permesso di confrontare gli animali malati tra loro e con i sani e il continuo e costante monitoraggio tramite ecografia ed esami ematologici ha consentito di determinare una relazione tra i diversi rilievi.
Lo scopo di questo lavoro è stato proprio quello di determinare un collegamento tra i ausili diagnostici (ematologici ed ecografici) e le prime fasi della malattia causata da R. equi, al fine di stabilire la validità diagnostica di questi mezzi e soprattutto la precocità, caratteristica indispensabile per limitare i danni economici determinati dalla malattia. Infatti, la rodococcosi, è una delle maggiori cause di perdite nell’allevamento equino proprio per le sue principali caratteristiche: è diffusa in tutto il mondo, ha un’alta resistenza ambientale, un’elevata trasmissibilità e colpisce quasi esclusivamente i puledri in cui causa le principali manifestazioni clinico – patologiche. Inoltre la terapia è una ulteriore fonte di spesa, soprattutto per la sua notevole durata.
Durante questo studio, sono stati presi in esame 25 puledri, di cui 13 hanno costituito il gruppo dei malati e di questi solo 3 hanno palesato la rodococcosi associata a sintomi clinici e rilievi diagnostici alterati in rapporto a quanto riportato in bibliografia, mentre gli altri sono stati colpiti da patologie respiratorie non riferibili a rodococcosi. Tra gli esami svolti per il monitoraggio, soprattutto l’ecografia e la conta leucocitaria, al contrario della fibrinogenemia, sono risultate indicatori precoci del processo flogistico in atto. Ovviamente i singoli esami non permettono la diagnosi definitiva ed è importante che siano integrati tra loro e soprattutto associati al monitoraggio della terapia. Importante sottolineare l’importanza di una buona esperienza clinica personale
associata all’eventuale esame necroscopico dei soggetti deceduti, esami istopatologici e nei soggetti ammalati, quando possibile, esami specifici per la rodococcosi quali il test ELISA su siero e la PCR o l’esame colturale dal BAL o essudato espettorato.
In conclusione, il management ottimale d’allevamento prevederebbe uno screening clinico regolare di tutti i soggetti con controlli giornalieri ed esami di laboratorio settimanali in modo da intervenire tempestivamente con le cure adeguate al caso.
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