La steatosi epatica è la più comune forma di malattia epatica cronica ed è caratterizzata dall’infiltrazione di trigliceridi negli epatociti.
La progressione del danno epatico in NAFLD si articola, secondo la teoria dei due colpi, in due fasi: nella prima, si ha accumulo di lipidi negli epatociti che rendono il fegato maggiormente suscettibile al danno ed, nella seconda fase, la progressione della patologia è dovuta alla disfunzione mitocondriale, allo stress ossidativo e alla produzione di citochine infiammatorie (Dowman J. K. et al., 2010).
L’utilizzo di modelli animali per lo studio di NAFLD sono essenziali per la comprensione dei meccanismi patologici della malattia. Un modello studiato negli ultimi anni è quello che combina una dieta iperlipidica con una bassa dose di streptozotocina, la quale danneggia le cellule β del pancreas, portando a diabete. In questo modo è possibile sviluppare un modello che rispecchi maggiormente la patologia umana.
Nella presente tesi è stato utilizzato questo modello per investigare il ruolo protettivo e anti-steatotico di un estratto acquoso di Kavolì®, studiandone l’effetto sullo stress ossidativo, sull’infiammazione e sul drug metabolism a livello epatico.
Inoltre, sono stati valutati anche alcuni parametri di stress ossidativo a livello del colon e dell’encefalo, poiché in letteratura sono presenti alcuni studi in cui la dieta sembra andare ad influenzare non solo l’asse intestino-fegato, ma anche il sistema nervoso centrale.
Un grande numero di studi epidemiologici riconoscono i benefici portati da una dieta ricca di frutta e verdura e il ruolo di protezione dei vegetali contro diverse patologie croniche (Cencic A. e Chingwaru W., 2010; Melega S. et al., 2013; Traka M. H. e Mithen R. F., 2011)
Le Brassicaceae costituiscono un gruppo di vegetali molto studiato ed al quale sono accreditate numerose proprietà benefiche principalmente per il loro contenuto di glucosinolati e di polifenoli. A questi ultimi composti è stata attribuita la potenziale azione antiossidante e detossificante nei confronti delle cellule e dei tessuti (Cartea M. E. et al., 2011).
Il gruppo più abbondante di polifenoli nella specie Brassica sono i flavonoidi e gli acidi idrossicinnamici (Cartea M. E. et al., 2011). Nello studio effettuato da Kaulmann A. et al., (2014) i polifenoli maggiormente ritrovati in alcune Brassicaceae analizzate sono stati l'acido clorogenico e i suoi isomeri, acido neo- e cryptoclorogenico, ma anche flavonoidi e antocianine, ai quali è stata attribuita l’attività antiossidante misurata attraverso i metodi ABTS e FRAP.
Nel presente studio sono stati caratterizzati i differenti polifenoli presenti sia nel Kavolì® “in toto”, che nell’estratto acquoso e i risultati mostrano la presenza di un’elevata quantità di acido clorogenico e di acido neoclorogenico nel Kavolì® ma, ancor di più, nel liofilizzato dell’estratto acquoso.
Oltre ai polifenoli, altri composti che sono stati ritrovati particolarmente abbondanti in diverse specie appartenenti alle Brassicaceae sono i glucosinolati (Fahey J. W. et al., 2001). I prodotti di degradazione dei GLS sono gli isotiocianati, i quali sono considerati composti bioattivi responsabili di numerosi effetti biologici. In particolare sembrano influenzare l’attività degli enzimi del metabolismo degli xenobiotici e attraverso l’interazione con Nrf2, up-regolare geni che codificano per enzimi antiossidanti (Barillari J. et al., 2007; Canistro D. et al., 2012; Valgimigli L. e Iori R. 2009; Vivarelli F. et al., 2016). Il prodotto commerciale Kavolì®, utilizzato in questo studio, è costituito da piccole foglie raccolte ad uno stadio giovanile dello sviluppo della pianta e appartiene alla famiglia delle Brassicaceae, specie di Brassica oleracea var. acephala.
I dati relativi alla sperimentazione in vivo hanno mostrato che i ratti trattati con streptozotocina e dieta iperlipidica si presentano diabetici con valori di glicemia > 250 mg/dl. La riduzione del peso corporeo in questi ratti è probabilmente dovuta alla presenza di questa patologia. Il trattamento con streptozotocina infatti danneggia le cellule β del pancreas e la produzione di insulina diminuisce drasticamente, come mostrato dai dati ematici. Non riuscendo ad utilizzare il glucosio come fonte di energia, le cellule utilizzano fonti energetiche alternative come il grasso nel tessuto adiposo, inducendo lipolisi, e le proteine muscolari, inducendone la degradazione. Il gruppo di
gruppo DIPL, anche questo può essere dovuto al trattamento con streptozotocina e alla riduzione dei livelli di insulina ematica.
Per quanto riguarda il consumo dell’alimento giornaliero non ci sono differenze significative tra i vari gruppi a conferma che i cambiamenti nel peso degli animali non sono dovuti a questo fattore.
Il peso relativo del fegato aumenta nei ratti trattati con dieta iperlipidica e nei ratti trattati con l’estratto di Kavolì®. Questo incremento probabilmente è dovuto all’accumulo di lipidi nel fegato e quindi alla presenza di steatosi.
Dai dati ematici possiamo vedere come i livelli di insulina si abbassino nel gruppo DIPL e ciò è dovuto al trattamento con la streptozotocina che ha portato a distruzione delle cellule β del pancreas. La funzione di regolazione dei livelli ematici di glucosio, propria dell’insulina, quindi, non avviene e di conseguenza troviamo i valori di glicemia alti. Questo conferma la presenza di diabete. Per quanto riguarda i livelli di glicemia e di insulina nei ratti trattati con Kavolì® non si sono evidenziate differenze rispetto ai DIPL. Le transaminasi sono i principali indici che riflettono il grado di danno a livello del fegato. Per entrambe è possibile osservare un aumento dei livelli ematici nei ratti trattati con dieta iperlipidica, in accordo con i dati presenti in letteratura per le diete iperlipidiche che inducono steatosi (Mnafgui K. et al., 2012). Quest’aumento rimane tale per le AST nel gruppo trattato con Kavolì®. Diminuiscono invece significativamente i livelli di ALT rispetto al gruppo DIPL nei ratti trattati con l’estratto acquoso di Kavolì®. Questo dimostrerebbe un miglioramento a livello del fegato poiché l’ALT è la transaminasi specifica per quest’organo.
La bilirubina risulta indotta in tutti i ratti trattati con la dieta iperlipidica confermando la presenza di un danno epatico.
Sia nei ratti trattati con dieta iperlipidica che nei ratti a cui è stato somministrato l’estratto di Kavolì®, i livelli ematici di colesterolo totale aumentano rispetto al controllo, poiché è stata somministrata una dieta contenente il 2% di colesterolo, oltre ad essere legato alla presenza di steatosi (Mnafgui K. et al., 2012).
Similmente i livelli ematici dei trigliceridi presentano un aumento significativo nei ratti trattati con dieta iperlipidica e con il Kavolì® rispetto al controllo. Questi valori sembrano
avere una tendenza a scendere leggermente nel gruppo trattato con Kavolì® rispetto al gruppo DIPL anche se le differenze non sono significative.
Per quanto riguarda gli enzimi di fase I questi risultano indotti rispetto al controllo nei ratti trattati con dieta iperlipidica e nei ratti a cui è stato somministrato il Kavolì® insieme alla dieta iperlipidica. L’induzione dei citocromi P450 è un aspetto tipico che si ritrova nella steatosi epatica. In particolare l’aumento dell’isoforma di CYP2E1, è una prerogativa tipica della dieta iperlipidica. Gli effetti portati da questo tipo di dieta, come il danno ossidativo, promuovono l’induzione dell’attività di tale isoforma ed in particolare gli acidi grassi ne inducono la trascrizione e la sua sintesi. Le attività marcatrici per questa isoforma risultano significativamente indotte nei ratti trattati con dieta iperlipidica in accordo con i dati in letteratura (Abdelmegeed M. A. et al., 2012; Lieber C. S. et al., 2004;). L’attività di questa isoforma è rilevante perché con il passare del tempo provoca un aumento della concentrazione di ROS che, insieme alla disfunzione mitocondriale porta ad un aumento dello stress ossidativo cellulare (Caro A. A. et al., 2004).
Nei ratti trattati con il Kavolì® sembra esserci un ulteriore induzione di questa isoforma per quanto riguarda l’attività del p-nitrofenolo idrossilasi (con un aumento di significatività p<0,05 nei DIPL e p<0,01 nei DIPL+KAV rispetto al controllo). In letteratura sono riportati dati contrastanti riguardo la modulazione degli enzimi di fase I in seguito alla somministrazione delle Brassicaceae. Sembra che a seconda dei glucosinolati presenti e quindi a seconda di quale isotiocianato viene a formarsi si abbiano modulazioni diverse (Barillari J. et al., 2007; Lampe J. W. e Peterson S., 2002). In alcuni lavori riportati in letteratura viene mostrato un aumento di questa isoforma modulata dalla Brassica oleracea L.var. acephala, come in quello di Melega S. et al., (2013) in ratti trattati con germogli di cavolo nero con aggiunta di miriosinasi esogena o in quello di Canistro D. et al., (2012) sempre in ratti trattati con un estratto di cavolo nero.
L’attività dell’anilina dipende dall’isoforma CYP2E1, ma in minima parte anche da altre isoforme (CYP1A1 e CYP1A2). Questa attività risulta, come già detto, indotta nei DIPL e rimane tale nella dieta con l’aggiunta di Kavolì®. Nel lavoro di Melega S. et al., (2013) l’isoforma CYP1A1 risulta inibita dai glucosinolati somministrati ai ratti sia in presenza
che in assenza di miriosinasi esogena mentre CYP1A2 aumenta in presenza di glucosinolati e miriosinasi esogena.
L’attività dell’ECOD mostra lo stesso andamento del p-NPH. L’ECOD rappresenta l’attività di diverse isoforme (CYP2E1, CYP1A1, CYP1A2, CYP2A e CYP2B). Possiamo ipotizzare quindi che questo andamento sia dovuto ad una modulazione dell’isoforma CYP2E1, da parte degli isotiocianati dell’estratto di cavolo nero.
Per quanto riguarda gli indici di stress ossidativo a livello del fegato sono stati presi in considerazione: la perossidazione lipidica, la carbonilazione delle proteine e il dosaggio del GSH. Lo stress ossidativo riflette uno stadio avanzato della patologia steatotica, infatti la presenza di specie reattive dell’ossigeno dovute ad una disfunzione mitocondriale rappresentano un momento critico che si verifica nella progressione della patologia da NAFLD a NASH. Nel nostro caso troviamo nel gruppo trattato con dieta iperlipidica una chiara evidenza di stress ossidativo in quanto è presente un aumento di perossidazione lipidica e di proteine carbonilate. Il trattamento con Kavolì® ha dimostrato avere un effetto antiossidante in quanto possiamo notare nel gruppo DIPL+KAV una diminuzione dei livelli di MDA e di proteine carbonilate (Chaturvedi P., 2008). I livelli di GSH non mostrano cambiamenti significativi tra i gruppi, anche se nel gruppo DIPL sembra esserci una diminuzione rispetto ai controlli.
La quantificazione dei lipidi epatici evidenzia un significativo aumento del loro contenuto nei ratti trattati con dieta iperlipidica rispetto ai valori di controllo, confermando la presenza di steatosi. La somministrazione della Brassica oleracea var.
acephala migliora il quadro steatotico poichè i ratti trattati con il Kavolì®, pur
continuando ad assumere la dieta iperlipidica per tutta la durata del trattamento, mostrano una significativa diminuzione del contenuto dei lipidi nel fegato rispetto al gruppo DIPL.
Nelle sezioni istologiche del gruppo DIPL si evidenzia una steatosi caratterizzata dalla presenza di alcune macrovescicole ed inoltre è possibile osservare un’evidente infiammazione localizzata a livello delle vene centrali e del sistema portale. Nei ratti trattati con l’estratto acquoso di Kavolì® sembra esserci un miglioramento soprattutto
riguardo all’infiltrato infiammatorio il quale, pur risultando presente, si riduce fortemente.
L’instaurazione di un processo infiammatorio è confermato anche dall’analisi dell’espressione di TNF-α che risulta maggiore nel gruppo DIPL. L’aumentata espressione di questa citochina pro-infiammatoria secreta soprattutto dalle cellule di
Kupffer, suggerisce l’attivazione di quest’ultime, evento che si verifica in uno stato
evoluto di steatosi epatica. Nel gruppo trattato con l’estratto acquoso di Kavolì® i livelli dell’mRNA di TNF-α diminuiscono significativamente dimostrando un effetto antinfiammatorio e antiossidante delle Brassicaceae riportato in letteratura (Raish M. et al., 2016). L’espressione genica di IL-6 presenta una tendenza simile a TNF-α, non evidenziando però differenze significative.
L’attività dell’enzima antiossidante eme ossigennasi 1, un gene target di Nrf2, risulta indotta significativamente nei DIPL rispetto ai controlli. Alcune ricerche riportano che l’attivazione del fattore Nrf2 avvenga solo in fasi successive della patologia cioè in presenza di una fase conclamata di NAFLD, suggerendo quindi che il nostro modello rappresenti una fase avanzata della NAFLD. Il gruppo KAV+DIPL mostra una diminuzione significativa dell’attività rispetto al gruppo DIPL.
L’attività della DT-diaforasi mostra un trend positivo di induzione nei gruppi DIPL e DIPL+KAV anche se non significativo.
Gli isotiocianati sono conosciuti per la loro capacità di attivare di enzimi antiossidanti come l’eme ossigenasi 1 o la DT-diaforasi attraverso il sistema di Nrf2 poichè favoriscono la distruzione del legame di questo fattore con Keap-1, con conseguente rilascio di Nrf2 che trasloca nel nucleo (Itoh K. et al., 1999) e attiva, legandosi agli elementi ARE, enzimi antiossidanti. Ci saremo aspettati quindi un’azione simile degli isotiocianati nella modulazione dell’attività di questi due enzimi. Per cui questo ultimo risultato non è facilmente spiegabile e probabilmente ha bisogno di essere approfondito.
L’espressione genica correla con l’attività di questi due enzimi in quanto l’espressione dell’eme ossigenasi 1 mostra livelli di espressione significativamente maggiori nel gruppo DIPL rispetto al controllo e, nel gruppo trattato con l’estratto di cavolo nero, i valori di espressione diminuiscono significativamente rispetto al gruppo DIPL. Nell’espressione della DT-diaforasi non si osservano variazioni significative ma si ha una
tendenza positiva nel gruppo trattato con l’estratto di Kavolì® in quanto l’espressione mostra un aumento rispetto agli altri gruppi.
Dal momento che l’estrazione del Kavolì® e la preparazione della soluzione somministrata ai ratti sono state fatte in acqua, le proprietà antiossidanti ed antinfiammatorie mostrate in questo studio sono da attribuirsi alle componenti idrosolubili.
Dalle analisi effettuate sulla caratterizzazione del profilo dei polifenoli emerge la presenza di un’elevata quantità di acido clorogenico. L’effetto protettivo di tale acido nei confronti del danno epatico e renale indotto da d-galattosio, è stato studiato in una ricerca di Feng Y. et al., (2016). In questo studio la somministrazione dell’acido clorogenico ha attenuato il danno organico dimostrando di possedere notevoli proprietà antiossidanti ed antinfiammatorie. Inoltre il ruolo dell’acido clorogenico nel controllo dello stress ossidativo e dell’infiammazione è stato mostrato anche da Liang N. e Kitts D. D. (2015). Possiamo quindi attribuire all’elevato contenuto di acido clorogenico il ruolo significativo mostrato dal Kavolì® nei confronti dello stress ossidativo e dell’infiammazione.
Secondo alcuni studi una dieta ricca di grassi porta ad una alterazione della microflora intestinale (Singh R. K. et al., 2017) e questo può successivamente promuovere lo sviluppo di alcune patologie associate alla disbiosi intestinale (Khan I. et al., 2017; Murphy E. A. et al., 2016). Nel nostro caso dopo circa due mesi di dieta iperlipidica non risulta esserci un aumento di stress ossidativo a livello del colon nei gruppi trattati con dieta iperlipidica. Nella carbonilazione delle proteine sembra esserci un trend (aumento nei DIPL e diminuizione nel DIPL+KAV), ma non sono differenze significative. Lo stato ossidativo non mostra variazioni neanche nel gruppo trattato con Kavolì® rispetto al controllo.
A livello dell’encefalo, invece, è possibile osservare nel gruppo DIPL una presenza chiara di stress ossidativo. Questa è evidenziata soprattutto dall’aumento di perossidazione lipidica e della carbonilazione delle proteine, anche se i livelli di GSH diminuiscono
leggermente nel gruppo DIPL, ma non in modo significativo. Questo può essere accreditato all’azione tossica della dieta iperlipidica e dell’iperglicemia i cui effetti sono riportati in alcuni lavori presenti in letteratura (Charradi K. et al., 2017; Saliu A. J. et al., 2016). Possiamo attribuire al Kavolì® un’azione antiossidante anche a livello dell’encefalo in quanto migliora lo stato assidativo sia a livello delle proteine carbonilate che della perossidazione lipidica.