3. Materiali e metodi
3.9 Perossidazione lipidica (MDA)
La perossidazione lipidica è un ottimo indicatore di stress ossidativo. Le specie reattive dell’ossigeno sono in grado infatti di reagire con i lipidi delle membrane danneggiandole e provocando la formazione di queste aldeidi tossiche. La concentrazione di malondialdeide (MDA) è stata analizzata seguendo il protocollo di Seljeskog E. et al., (2006), con qualche modifica.
3.9.1 Misurazione fluorimetrica
Per estrarre l’MDA i campioni di colon sono stati omogeneizzati con tampone di omogenizzazione (10 volumi) a temperatura ambiente. A questo punto 100 µl di campione sono stati prelevati ed aggiunti ad acido perclorico (PCA 0,11 N) e acido tiobarbiturico (TBA 40 mM). I campioni sono stati agitati su un vortex per 10 secondi e messi in bagnetto a 95°C per 1 ora. Successivamente sono stati tolti dal bagnetto e posti a -20 °C per 20 minuti. A questo punto è stato aggiunto metanolo e TCA 20%. Dopo aver centrifugato a 10000 rpm per 20 minuti è stata effettuata la lettura dei campioni grazie al fluorimetro (Ex 525 nm e Em 560 nm).
È stata costruita una retta di taratura attraverso la preparazione di tetraetossipropano (TEP, 6,7 mM) in una soluzione 1% di acido solforico tenuta a 37°C per venti minuti per far avvenire l’idrolisi. Da questa soluzione madre sono state effettuate delle diluizioni per avere le seguenti concentrazioni: 33,5 µM, 16,8 µM, 8,4 µM, 4,2 µM, 2,1 µM, 1,1 µM, 0,5 µM. Si è quindi proceduto con le operazioni del protocollo sopra descritto. Il bianco ottenuto, aggiungendo acqua al posto del TEP, è stato sottratto alle diverse concentrazioni (Seljeskog E. et al., 2006).
3.9.2 Misurazione spettrofotometrica
La perossidazione lipidica dei campioni di fegato e cervello è stata eseguita con la collaborazione del Dottor Francesco Vizzarri del Dipartimento di Ambiente, Agricoltura e Alimenti dell’Università del Molise.
Il tessuto di fegato e di cervello è stato omogeneizzato in KCL 1,15%. Successivamente alla soluzione sono stati aggiunti acido tricloroacetico (TCA), acido tiobarbiturico (TBA) e acido cloridico (HCl). I campioni sono stati mantenuti per 15 minuti in acqua bollente, e, dopo averli raffreddati, sono stati centrifugati a 1000 rpm per 10 minuti. L’assorbanza del sovranatante è stata misurata alla lunghezza d’onda di 532 nm utilizzando un bianco costituito da tutti i reagenti ad eccezione dell’omogenato del tessuto. Il coefficiente di estinzione molare utilizzato per calcolare la concentrazione della malondialdeide è stato 1,56 x 105M-1 cm-1(Ohkawa H. et al., 1979).
3.10 Carbonilazione proteica
Per la determinazione dello stress ossidativo la carbonilazione proteica risulta essere il metodo migliore poiché le proteine carbonilate risultano più stabili e rendono la metodica più affidabile. Il metodo consiste nell’aggiungere gruppi carbonilici sulla catena laterale di alcuni residui amminoacidici (prolina, lisina, arginina e treonina). Il composto 2,4- dinitrofenil idrazina (DNPH) reagisce con il gruppo carbonilico delle proteine convertendosi a 2,4-dinitrofenil idrazone, rilevabile spettrofotometricamente. Sono stati pesati circa 0,3 grammi di tessuto di fegato, encefalo e colon di ratto e omogenizzati in tampone di estrazione (1:7). Dall’omogenato è stato prelevato 1 ml totale di cui 0,5 ml sono stati aggiunti a 0,5 ml di HCl 2M (bianco) e 0,5 ml sono stati aggiunti a 0,5 ml di DNPH. I campioni sono stati mantenuti in agitazione per un’ora per far avvenire la reazione tra il composto DNPH e i gruppi carbonilici (CO) delle proteine. Successivamente è stato aggiunto TCA (0,5 ml), per far precipitare i prodotti che si sono formati. Dopo aver tenuto in agitazione per 15 minuti è stata effettuata una centrifugazione dei campioni a 3000 rpm per 10 minuti. Scartato il sovranatante, sono stati effettuati tre lavaggi con l’aggiunta di 1 ml di etanolo etilacetato (1:1, v/v) e successivamente i campioni sono stati centrifugati a 3000 rpm per 10 minuti. Il pellet quindi è stato risospeso in 2 ml di Guanidina-HCl e dopo aver tenuto in agitazione per 15 minuti e aver centrifugato per 10 min a 3000 rpm è stata effettuata la lettura a 390 nm. Il coefficiente di estinzione molare utilizzato è 21 mM¯¹ cm¯¹ (Harishekar M. B. e Kiran B. 2011; Mercier Y. et al., 2004; Terevinto A. et al., 2010).
3.11 Lipidi epatici
L’estrazione dei lipidi è stata effettuata a partire dal tessuto epatico. È stato seguito il metodo di Folch J. et al., (1957) adattato al nostro sistema sperimentale. 0,5 g di campioni di fegato sono stati omogeneizzati con 2 ml di acqua bidistillata e 2 ml di metanolo. Successivamente sul risultante omogenato sono state effettuate 3 successive fasi di estrazione con 2 ml di cloroformio. Per ogni fase di estrazione è stata eseguita una centrifugazione a 3000 rpm per 5 minuti. Le varie frazioni di cloroformio sono state riunite insieme e lavate con 2 ml di KCl 1M e successivamente con 2 ml di acqua bidistillata. A questo punto è stato fatto evaporare l’estratto ottenuto in piastre apposite per 24 ore fino al raggiungimento di un peso costante, quindi è stato pesato e quantificato il contenuto in lipidi epatici per grammo di tessuto.
3.12 Attività enzimatiche
3.12.1 Etossicumatina-O-deetilasi (ECOD)
Questa misurazione riflette l’attività di diverse isoforme del citocromo P450 ed è stata effettuata su frazioni microsomiali epatiche. Attraverso la deetilazione dell’etossicumarina ad opera di vari enzimi P450 viene prodotta la 7-idrossicumarina (umbelliferone) della quale viene effettuata la misurazione fluorimetrica (Ex 390 nm e Em 440 nm). Sono state preparate per ogni campione 3 provette con 500 µl di cofattori 1X (NADP 0,6mM + G6P 7mM), 20 µl di cloruro di magnesio (250mM), 66 µl di ECOD (1,5 mM), 250 µl di TCA (0,31 M, solo nei bianchi), tampone risospensione (0,1 mM) e microsomi (per avere 0,3 mg) per arrivare ad 1 ml di volume totale di reazione. Sono stati aggiunti 3 µl della glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH) ad intervalli regolari, per 10 minuti allo scadere dei quali è stata bloccata la reazione con 250 µl di TCA aggiunto agli stessi intervalli. Sono stati successivamente inseriti 2 ml di tampone NaOH- glicina (1,6 M) e dopo aver centrifugato per 5 minuti a 3000 rpm è stata effettuata la lettura al fluorimetro (Ex 390 nm e Em 440 nm). Questo protocollo permette di rilevare valori di attività catalitiche maggiori di 0,2 pmol/min/mg prot (Aitio A., 1978).
3.12.2 p-Nitrofenolo idrossilasi (pNPH)
Il p-nitrofenolo è un substrato che viene idrossilato dall’isoforma CYP2E1 in una reazione che produce il 4-nitrocatecolo, un composto di colore giallo con un picco di assorbimento massimo a 546 nm (Reinke L. A. e Moyer M. J., 1985).
In un volume finale di reazione di 1 ml sono stati aggiunti 20 µl di cloruro di magnesio (250mM), 100 µl di cofattori (5X), 50 µl di p-nitrofenolo (2 mM), tampone TRIS (0,1 M a ph 6,8) e microsomi (per avere 1 mg). I campioni sono posti a 37 °C per 5 minuti al termine dei quali è stata aggiunta G6PDH (5 µl) ad intervalli regolari in ogni provetta. Dopo 15 minuti di incubazione la reazione è stata bloccata con acido perclorico (0,6 N). Dopo aver centrifugato è stato prelevato il sovranatante al quale è stato aggiunto NaOH 10 N. La lettura dei campioni è stata effettuata allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 546 nm.
Questo protocollo permette di determinare valori di attività maggiori di 0,1 pmol/(mg*prot*min)
3.12.3 Anilina idrossilasi (AnH)
L’idrossilazione P450-dipendente dell’anilina porta alla formazione del 4-amminofenolo che in presenza di fenolo forma un complesso di colore blu (il fenato corrispondente) con un picco di assorbimento a 630 nm. Attraverso questo saggio vengono determinati i livelli microsomiali delle isoforme CYP2E1 (principalmente), CYP1A2 e CYP1A1.
In un volume finale di reazione di 1 ml vengono aggiunti 500 µl di cofattori (1X), 20 µl di cloruro di magnesio (250mM), 50 µl di anilina, tampone fosfato (0,1 M ph 7,4), microsomi (per avere 1 mg), incubati a 37° per 5 minuti. È stata quindi aggiunta G6PDH ad intervalli regolari e dopo 30 minuti la reazione è stata bloccata con 500 µl TCA 20%. I campioni sono stati quindi centrifugati a 5000 rpm per 5 minuti e il sovranatante è stato aggiunto a 500 µl di carbonato di sodio (1M) e 1 ml di fenolo (al 2% in NaOH 0,2 N). Dopo un’incubazione di 20 minuti a 37 °C è stata misurata la quantità di fenato formato allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 630 nm.
3.12.4 Eme ossigenasi (HO-1)
Il dosaggio dell’HO-1 consiste nella rilevazione spettrofotometrica della bilirubina, prodotta a seguito della riduzione della biliverdina. La reazione richiede 10 µl di emina (2mM) come substrato, una fonte di biliverdina reduttasi (3 mg di frazione citoplasmatica) e 2 mg di campione microsomiale contenente HO-1. Oltre a questi componenti sono stati aggiunti anche 10 µl di cloruro di magnesio (250 mM), 100 µl NADP (8 mM in tampone fosfato), 100 µl G6P (20 mM in tampone fosfato) e tampone fosfato (0,1 M a ph 7,4) per arrivare ad 1 ml di volume di reazione. I campioni sono stati incubati per 5 minuti a 37 °C e successivamente è stata aggiunta G6PDH per far partire la reazione. Dopo 90 minuti è stato aggiunto cloroformio per bloccare la reazione, dopo agitazione delle provette e successiva centrifugazione per 15 minuti a 3500 rpm è stata misurata la quantità di bilirubina formata allo spettrofotometro come differenza di assorbanza alle lunghezze d’onda 464 nm e 530 nm (Naughton P. et al., 2002).
3.12.5
DT-diaforasi
(NAD(P)H
chinone
ossidoreduttasi-NQO1)
Questa attività viene determinata nella frazione citosolica epatica seguendo la riduzione del DCPIP (2,6-diclorofenolindofenolo) da parte del NADPH, che porta ad una diminuzione dell’intensità della colorazione del DCPIP, misurata spettrofotometricamente a 630 nm.
Il coefficiente di estinzione molare è pari a 21,2 mM-1 cm-1. (Benson A. M. et al., 1980).