DNA virale nella popolazione cellulare per MOI 1

La Figura 4.3 mostra l’andamento nel tempo della percentuale di cellule positive a ciascuno dei 4 fattori, ovvero quelle cellule che contengono almeno una molecola di DNA virale, ricordando che tale variabile è una quantità discreta. I risultati ottenuti fanno riferimento a 10 simulazioni eseguite.

Figura 4.3 Profilo temporale della percentuale di cellule positive per MOI 1, con rapporti

stechiometrici 3:1:1:1; A) Oct4, B) Sox2 C) Klf4 D) c-Myc. La barra di errore indica la deviazione standard di 10 simulazioni stocastiche eseguite.

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Poiché l’infezione è stata condotta con rapporti stechiometrici 3:1:1:1, la percentuale di cellule positive a Oct4 è circa il doppio rispetto quelle positiva a Sox2, Klf4 e c-Myc. Da questo risultato si comprende che non vi è una corrispondenza lineare tra MOI ed efficienza di infezione. Ciò è dovuto all’effetto stocastico del processo di infezione regolato dal moto dei virus. Dal momento che i rapporti stechiometrici tra Sox2, Klf4 e c-Myc sono pari a 1, si ottengono risultati statisticamente equivalenti per questi tre fattori. Questo concetto vale anche per i risultati che verranno analizzati in seguito. È possibile inoltre notare una diminuzione della percentuale di cellule positive che avviene tra i tempi _hⁱ e _ⁱ, e tra _hⁱⁱ e _ⁱⁱ. Questa diminuzione è dovuta alla duplicazione cellulare che porta ad una diluizione del DNA virale contenuto nelle cellule madri e che si ripartisce secondo la distribuzione in Figura 3.8. Perciò avviene una diminuzione del numero di cellule positive perché, per esempio, se all’istante 0 una cellula conteneva una molecola di DNA virale, dopo la sua duplicazione se ne è formata una con nessuna molecola di DNA contenuta all’interno e una con una molecola di DNA virale, di conseguenza aumenta il numero di cellule non positive. L’incremento che emerge tra _ⁱ e _hⁱⁱ è dovuto alla somministrazione di nuovi virus durante il secondo ciclo di infezione. Si può notare che i risultati relativi alla percentuale di cellule positive hanno una bassa variabilità stocastica, essendo la deviazione standard bassa (in Figura 4.3 la barra di errore è più piccola del marker impiegato). Il basso valore della deviazione standard è dovuto al fatto che la variazione stocastica si distribuisce su un numero elevato di cellule, perciò le 10 simulazioni eseguite risentono poco della fluttuazione stocastica.

Un’analisi più precisa della quantità di DNA virale viene fornita dalla Figura 4.4 che indica la percentuale di cellule che contengono un certo numero di molecole di DNA virale, indicato in ascissa.

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Figura 4.4 Percentuale di cellule presenti nella popolazione che contengono un certo numero di

molecole di DNA virale indicato, in ascissa, per MOI 1; A) Oct4, B) Sox2 C) Klf4 D) c-Myc. La barra di errore indica la deviazione standard di 10 simulazioni stocastiche eseguite.

L’andamento qualitativo dei grafici della Figura 4.4 conferma i risultati presentati in Figura 4.3: si ha una diluizione della quantità di DNA virale contenuta nella popolazione tra il tempo _hⁱ e _ⁱ, e tra _hⁱⁱ e _ⁱⁱ con uno spostamento delle curve verso sinistra e un aumento del numero di cellule non contenenti nessun virus. Inoltre, gli andamenti per Sox2 Klf4 e c-Myc sono statisticamente equivalenti mentre per Oct4, fornito in eccesso rispetto agli altri fattori, è minore il numero di cellule non infettate ed è presente un numero di cellule significativo contenente 2 virus.

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Analizzando il virus contenente Oct4, alla fine del II ciclo si ottiene un 30% della popolazione che è infetta da una sola molecola di DNA virale, mentre il 10% è infettato da 2 molecole di DNA. Focalizzandosi sul fattore Oct4, queste percentuali vanno diminuendo con l’aumento del numero di DNA virale all’interno della cellula: si va da un 40% delle cellule che hanno una molecola di DNA virale, ad un 3% che ne hanno cinque, ma per avere una tale quantità si è dovuto ricorrere al secondo ciclo di infezione. Osservando i grafici relativi agli altri tre fattori si nota, come ci si aspettava, che le percentuali di cellule positive al DNA virale contenente Sox2, Klf4 e c-Myc sono nettamente inferiori rispetto Oct4. In particolare il 10% della popolazione è positiva a una molecola di DNA di Sox2 mentre solo l’1% è positivo a 2 molecole. In generale il numero di molecole di DNA virale in tutti e quattro i casi è piccolo, questo è dovuto dal fatto che la MOI è 1. Perciò è statisticamente improbabile che una percentuale consistente di cellule abbia almeno 2 DNA virali per ciascuno dei 4 fattori di trascrizione. Si ricorda inoltre che questa condizione è necessaria, anche se non sufficiente, per indurre i meccanismi di reprogramming. Inoltre la diluizione per effetto della duplicazione cellulare è molto inferiore durante il secondo ciclo di infezione rispetto il primo. Ciò è dovuto dal fatto che già dopo il primo tempo di inter-infezione si è quasi raggiunta la concentrazione di confluenza.

Un dettaglio maggiore viene fornito dalle Figure 4.5-6-7 che rappresentano il substrato microfluidico, sul quale è adesa la popolazione cellulare. L’intensità del verde indica il numero di DNA virale presente in ciascuna cellula, mentre le zone colorate in nero rappresentano la posizione delle cellule che non hanno molecole di DNA.

Figura 4.5 Numero di molecole di DNA, che codifica per Oct4, contenuto in ogni cellula della

popolazione adesa sul substrato microfluidico all’inizio ed al termine di ogni ciclo di infezione con MOI 3; A) matrice jW_hiY, B) matrice jW_iY, C) matrice jW_iiY.

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Figura 4.6 Numero di molecole di DNA, che codifica per Sox2, contenuto in ogni cellula della

popolazione adesa sul substrato microfluidico all’inizio ed al termine di ogni ciclo di infezione con MOI 1; A) matrice jW_hiY, B) matrice jW_iY, C) matrice jW_iiY.

Figura 4.7 Numero di molecole di DNA, che codifica per Klf4, contenuto in ogni cellula della

popolazione adesa sul substrato microfluidico all’inizio ed al termine di ogni ciclo di infezione con MOI 1; A) matrice jW_hiY, B) matrice jW_iY, C) matrice jW_iiY.

Comparando la Figura 4.5 con le Figure 4.6 e 4.7 si osserva che l’intensità del verde è più elevata nel primo caso. Questo è dovuto al fatto che mediamente il numero di molecole di DNA, che codificano per la proteina Oct4, contenuto in tutta la popolazione è maggiore. La Figura 4.5 mostra l’effetto del secondo ciclo di infezione che contribuisce ad aumentare non solo la percentuale delle cellule positive ma anche il numero di molecole presenti nelle cellule che si vanno a sommare a quelle che erano già contenute nel ciclo precedente. Questa caratteristica è meno visibile se si osservano le cellule aventi DNA relativo a Sox2 e Klf4 (Figure 4.6-7). Ciò è dovuto alla bassa MOI rispetto a quella relativa ad Oct4. Si nota anche

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che i risultati che forniscono le due figure sono statisticamente equivalenti, ragion per cui si omette la rappresentazione che riguarda c-Myc. Si è visto che per aumentare il numero di molecole di DNA virale contenute nelle cellule si può agire su due variabili operative: aggiungere più cicli di infezione ed incrementare la MOI relativa a tutti e quattro i fattori.