CAPITOLO 5 – Analisi di sensitività
5.1 SIMULAZIONE DI RIFERIMENTO
Per condurre l’analisi di sensitività si è fissata una simulazione di riferimento, caratterizzata dalle condizioni riportare in Tabella 5.1.
Tabella 5.1 Valori dei gradi di libertà per la simulazione di riferimento.
Variabile Valore
Concentrazione di semina, Conc_semina 80 10-6 cellule/µm2 N° cicli di infezione, n_infezioni 2
Durata dei processi intracellulari, ti_i (121, 121) h
MOI 20 [n°virus/cellula]
Di seguito viene riportato una rielaborazione dei risultati ottenuti nel capitolo 4 alle condizioni indicate in Tabella 5.1. Tutti i risultati presentati in questo capitolo fanno riferimento alla stechiometria 3 (Oct4) : 1 (Sox2) : 1 (Klf4) : 1 (c-Myc), risultata ottimale da studi di letteratura [Paparetrou et al., 2009]. Quindi alle condizioni nominale Oct4 ha MOI 60 e Sox2 ha MOI 20. La Figura 5.1 mostra la percentuale di cellule che contiene un certo numero di molecole di Oct4 e Sox2 al termine dell’ultimo ciclo di infezione.
100
Figura 5.1 Andamento Distribuzione del numero di molecole di fattori di trascrizione per cellula
nella popolazione cellulare. Condizione di riferimento riportata in Tabella 5.1; A) Oct4, B) Sox2.
Dalla Figura 5.1 emerge che per MOI 60 il punto di massimo della distribuzione è costituito dal 2,5% della popolazione cellulare contenente 2800 molecole di Oct4, mentre per MOI 20 dall’8% delle cellule contenente 1000 molecole di Sox2. Tuttavia calcolando la media pesata su tutta la popolazione cellulare del numero delle proteine Oct4 e Sox2 per cellula si ottengono valori di 2296 e 797, rispettivamente. Questi valori sono molto inferiori a quelli del punto di massimo. In Figura 5.1 si nota che la distribuzione di proteine è costituita da una distribuzione ben definita di tipo gaussiano a livelli discreti e da una distribuzione con livelli molto ravvicinati a bassi numeri di proteine per cellula. Questa seconda distribuzione è dovuta all’effetto della duplicazione cellulare, che produce cellule con un limitato numero di proteine, ed include la maggio parte delle cellule presenti nella popolazione. per questo la media dell’intera distribuzione è molto inferiore a quella della distribuzione di tipo gaussiano. Ad MOI più elevati, è il caso di Oct4 rispetto a Sox2, il contenuto di proteine per cellula mediamente aumenta e la percentuale di cellule che contiene un certo numero di proteine diminuisce rendendo la distribuzione più eterogenea. È possibile quantificare l’eterogeneità della popolazione cellulare mediante il calcolo della deviazione standard pesata, che vale 1035 per Oct4 e 483 per Sox2. Ad MOI più elevati la deviazione standard è maggiore, quindi la distribuzione di proteine nella popolazione cellulare è più eterogenea. Calcolando il coefficiente di variazione, CV, delle distribuzioni riportate in Figura 5.1, è possibile normalizzare la deviazione standard,
σ
w, rispetto alla media, xw, secondo l’equazione:101
∑
∑
∑
∑
= = = = − = = N i i N i i i N i i N i w i i w w w w x w x x w x CV 1 1 1 1 2 ) (σ
(5.1)dove wi rappresenta la percentuale di cellule avete un numero di proteine per cellula pari a xi. quindi, all’aumentare della MOI, il CV è maggiore, dimostrando che l’aumento della media (al denominatore nell’Equazione 5.1) influisce maggiormente sul CV rispetto all’aumento della deviazione standard (al numeratore).
La Figura 5.2 riporta una rielaborazione dei dati presentati nella Figura 4.28. La percentuale di binding è definita come il numero di promotori ai quali una certa combinazione di fattori di trascrizione si lega rispetto al numero totale di promotori target per quella combinazione che sono stati identificati in letteratura [Kim and Orkin et al., 2008], secondo l’equazione:
L4\k4lmno4 `p qpl`plr =GQCIEF &D EFCFFED D
GQCIEF &D EFCFFED EsI ∙ 100% (5.2) In Figura 5.2 viene riportata la percentuale di binding per ciascuna combinazione di fattori di
trascrizione (FT) che possono attaccarsi ad uno stesso promotore. Per esempio, considerando i promotori ai quali si possono legare Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc (OSKM), si possono distinguere cinque casi:
-Nessun FT si lega ad un promotore (in rosso in Figura 5.2);
-Un tipo di FT si lega al corrispondente promotore (in arancione in Figura 5.2); -Due tipi di FT si legano ai corrispondenti promotori (in verde in Figura 5.2); -Tre tipi di FT si legano ai corrispondenti promotori (in azzurro in Figura 5.2); -Tutti e quattro i FT si legano ai relativi promotori, (in blu in Figura 5.2).
Questa visualizzazione mostra il binding del DNA effettivo da parte dei fattori di trascrizione rispetto a quello di saturazione dei promotori disponibili. Per motivi di visualizzazione, i grafici a barre della Figura 5.2 riportano soltanto i dati medi su tutta la popolazione cellulare.
102
Figura 5.2 Percentuale di binding alla condizione di simulazione di riferimento. La legenda
indica il numero di fattori di trascrizione attaccati ad uno stesso promotore.
Si può notare che il 60% dei promotori disponibili per l’attacco di Oct4, rilasciato a MOI 60, viene occupato. Nel caso di Sox2, Klf4 e c-Myc, tutti rilasciati con MOI 20, la percentuale di binding differisce da fattore a fattore, a causa del diverso numero di promotori a cui questi fattori possono legarsi. Il numero di promotori target per Sox2, Klf4 e c-Myc è 234, 770 e 2507 rispettivamente, per questo la percentuale di binding e' minore passando da Sox2 a c-Myc. In generale, confrontando i dati riportati in Figura 3.20, maggiore è il numero di promotori target relativo alle possibili combinazioni di fattori, minore è la percentuale di binding.
Osservando la percentuale di binding relativa ai promotori target sia per Oct4 che per Sox2 (OS), l’80% di questi promotori vengono occupati ed in particolare il 40% dei promotori ha 2 fattori di trascrizione legati ed il rimanente 40% ha un solo fattore. Sebbene il numero di promotori target per Oct4-Sox2 sia maggiore rispetto quelli relativi a Oct4-Klf4 (101 e 46 rispettivamente) la percentuale di binding di OK è del 70%. Questa deviazione dal comportamento generale descritto precedentemente e' dovuto alla regolazione del binding secondo un meccanismo cooperativo positivo tra Oct4 e Sox2 (Figura 3.21C). Tale effetto e' evidente anche confrontando la percentuale di binding di OS e SK (aventi un numero di promotori target pari a 101 e 106, rispettivamente). Si nota che il 40% dei promotori disponibili per OS vengono occupati dai relativi due fattori di trascrizione, mentre per SK tale percentuale si riduce al 10%.
Un risultato di cui si terrà particolare conto nell’analisi di sensitività è la percentuale di binding dei promotori OSKM, in particolare la percentuale di quelli che hanno tutti e quattro i
103
FT attaccati. Alle condizioni nominali di simulazione si ha che il 2 % dei promotori relativi a OSKM vengono occupati dai quattro fattori.
Di seguito si analizzerà l’effetto di una variazione nelle principali variabili operative (MOI, 60 e 20) sul profilo genetico conseguente all’infezione. In particolare, gli output del modello considerati saranno quelli analizzati nelle Figure 5.1 e 5.2 per il caso nominale.