CAPITOLO 1 – Cellule staminali e stato dell’arte nella riprogrammazione cellulare….3
1.6 MODELLI MATEMATICI
1.6.5 Modelli stocastici di riprogrammazione cellulare
−
→
→
→
−
→
τ τ]
[
]
[
(1.16)1.6.5 Modelli stocastici di riprogrammazione cellulare
Quantificare l'efficienza e la tempistica degli eventi che si verificano durante la riprogrammazione cellulare in vitro è problematico a causa dell’eterogeneità cellulare e genetica delle cellule somatiche infettate. La riprogrammazione delle cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti avviene attraverso l’espressione di 4 fattori di trascrizione come già discusso nel paragrafo 1.2.2, ma solo una piccola frazione delle cellule contenenti i quattro fattori può progredire verso la pluripotenza. L’efficienza di riprogrammazione è dello 0,05%, ciò significa che su 2000 fibroblasti solo uno è in grado di dar vita ad una cellula pluripotente. Inoltre molte cellule ritenute pluripotenti, in realtà, subiscono un parziale processo di riprogrammazione, dovuto ad una dipendenza diretta dell’espressione continua dei transgeni dei fattori di programmazione per il loro autorinnovamento. Bassa efficienza e parziale riprogrammazione rappresentano gli ostacoli maggiori che influiscono pesantemente
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nell’ottenimento delle cellule iPS. Dato che, anche dopo il controllo di valori adeguati di Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc, si hanno basse efficienze e parziali riprogrammazioni, si è indagato su questioni relative ai meccanismi di base della riprogrammazione epigenetica: come funziona il processo di riprogrammazione, cosa accade alla maggior parte delle cellule che non diventano riprogrammate nella fase di crescita cellulare continua e cosa succede durante l'espressione dei fattori di riprogrammazione. La risposta a tali domande è stata quella di considerare la riprogrammazione come un processo stocastico continuo [Hanna et al.,
2009], in cui la conversione di una cellula somatica in una cellula iPS può essere pensato
come una deriva dello stato delle cellule. Questo stato delle cellule può essere definito da percorsi o fluttuazioni di espressione genica o epigenetici. Queste fluttuazioni sono probabilmente dovuti all’eterogeneità della cellula o alla natura intrinseca stocastica dell’espressione genica.
Il processo di riprogrammazione può essere rappresentato dal punto di vista matematico utilizzando due differenti tipologie di modelli:
-Modello deterministico o anche modello elite in cui la riprogrammazione diretta avviene
solo in un sottogruppo di cellule trasdotte in un tempo di latenza fissato, pari ad un valore costante;
-Modello stocastico, in cui tutte o la maggior parte delle cellule sono competenti per essere
riprogrammate a cellule staminali pluripotenti indotte, sebbene ciò avviene con diversi tempi di latenza.
Figura 1.10 Modello di progressione allo stato pluripotente durante la diretta riprogrammazione
[Hanna et al., 2009].
La latenza è il tempo assoluto o numero di divisioni della cellula a cui è sottoposta la cellula fino ad ottenere un numero cospicuo di cellule figlie iPS. Il modello deterministico presuppone che solo poche cellule sono competenti per la riprogrammazione. Questo modello può essere ulteriormente suddiviso in due categorie:
-Modello “elite predeterminato”,
- Modello “elite indotto”.
Nel modello predeterminato, un piccolo numero di cellule sono competenti per la riprogrammazione di trasduzione retrovirale, anche prima dei quattro fattori. Nel modello indotto, oltre ai quattro fattori, i geni dei fattori devono essere attivati o inattivati dall’integrazione virale nella cellula ospite. Perciò solo le cellule con specifici siti virali d’integrazione sono competenti per la riprogrammazione. La generazione delle cellule iPS può essere promossa dall’attivazione o inattivazione dei geni endogeni da retrovirus o
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lentivirus, aumentando così la proliferazione, diminuendo l’apoptosi (morte cellulare programmata) o aumentando la riprogrammazione. Inoltre, l’espressione dei transgeni è fortemente influenzata dalla posizione dell’integrazione retrovirale, ogni cellula trasdotta ha un unico percorso d’integrazione e questo spiega perché solo una porzione molto limitata di cellule trasdotte completa il processo di riprogrammazione
Figura 1.11 Grafici che mostrano la forma generale delle cinetiche di riprogrammazione nei
diversi modelli [Hanna et al., 2009].
Nel modello stocastico, una volta introdotti i 4 fattori di trasduzione, molte cellule differenziate hanno la possibilità di diventare cellule iPS. La differenziazione delle cellule è spesso descritta (Figura 1.12) come una sfera che rotola giù verso un paesaggio epigenetico, descritto da Conrad Waddington nel 1957 [Waddington 1957]. Ogni cellula, parte dallo stato di cellula totipotente, attraversa lo stato di pluripotenza e rotola giù verso lo stato di
lineage-committed. Le cellule pluripotenti sono in uno stato transitorio (come se fosse uno stato
metastabile), sono in pendenza e non possono fermarsi e per effetto della gravità sono rapidamente differenziate in vari lineages. Le cellule staminali, invece, possono auto rinnovarsi e mantengono così la pluripotenza per lungo tempo (interpretando la figura si raggiunge una “buca di potenziale”).
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Figura 1.12 Rappresentazione schematica della differenziazione cellulare [Andrews et al., 2004].
Si ha la completa riprogrammazione se i quattro fattori sono espressi in un percorso che porti ad avere uno stimolo sufficiente nella giusta direzione e se ognuna delle cellule è intrappolata all’interno di una delle valli di cui è costituito il paesaggio epigenetico, così che loro possono rimanere nella zona di pluripotenza, anche dopo che l’espressione del transgene è scomparsa. La prima richiesta può essere raggiunta solo stocasticamente, perché le tecnologie a disposizione non consentono di controllare con precisione i livelli di espressione dei 4 transgeni. I quattro fattori di riprogrammazione non riescono da soli a creare le protuberanze epigenetiche, quindi anche la generazione delle cellule staminali pluripotente indotte richiede la presenza di eventi stocastici. Hanna et al. simulano il processo di riprogrammazione cellulare in maniera stocastica, considerando che il processo avvenga in ogni singola cellula. Per stimare la velocità intrinseca di riprogrammazione per ogni cellula, Hanna et al. hanno testato se il modello stocastico è in grado di descrivere i loro dati sperimentali. Il modello considera (Figura 1.13) la riprogrammazione delle B cellule che si verifica in uno step del processo con una costante di velocità k per ogni cellula intrinseca e N(t) indica il numero di cellule in ogni pozzetto.
Figura 1.13 Rappresentazione del modello di riprogrammazione considerato da Hanna [Hanna et
al.2009].
Il tempo di latenza è dato dalla somma del tempo necessario affinché la prima B cellula dell’intera popolazione sia riprogrammata, più il tempo di ritardo, tp, durante il quale la
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cellula figlia ha bisogno di crescere per raggiungere la soglia di rilevamento. Ad ogni istante di tempo e per ogni pozzetto, pesa la velocità alla quale si verifica il primo evento di riprogrammazione, diminuisce il numero della popolazione N(t) e la distribuzione di probabilità cumulativa di riprogrammazione nel tempo è pari a:
τ k p
e
t
t
P( + )≈1−
− (1.17) Dove τ è il tempo in cui la popolazione è ridimensionata:t d t N t ′ ′ =
∫
0 ) (τ
(1.18)Quindi la probabilità diventa:
0 ) ( 0