CAPITOLO 7 MATERIALI E METODI
7.6 Esami di laboratorio
I test di cui ci siamo serviti per valutare stress ossidativo e capacità antiossidante sono rispettivamente il d-ROMs e il BAP test.
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7.6.1 d-ROMs test
Nel d-ROMs (Reactive Oxygen Metabolities, derivates) test, i metaboliti reattivi dell'ossigeno (idroperossidi principalmente) di un campione biologico, in presenza di ferro rilasciato dalle proteine plasmatiche da un tampone acido, sono in grado di generare radicali alcossilici (R-O) e perossilici (R-OO), secondo la reazione di Fenton. Tali radicali, a sua volta, sono in grado di ossidare un'ammina aromatica sostituita (A-NH2, contenuta in
una miscela cromogena), producendo così un derivato di colore rosa, secondo le reazioni: 1. R-OOH + Fe2+ -> R-O + Fe2+ + OH-
2. R-O + A-NH2 -> R-O- + [A-NH2]+
3. R-OOH + Fe3+ -> R-OO + Fe2+ + H+
4. R-OO + A-NH2 -> R-OO- + [A-NH2]+.
Le reazioni 1 e 2 valgono per i radicali alcossilici, mentre la 2 e la 3 per i radicali perossilici (Diacron Labs. S.r.l. Grosseto). Il derivato rosa così ottenuto viene quantificato fotometricamente a 505 nm (Alberti et al., 2000). La concentrazione dei ROMs sarà direttamente proporzionale all’intensità di colore e sarà espressa come Carratelli Unità (1 CARR U = 0,08 mg di perossido di idrogeno/dl) (Pasquini et al., 2007).
Procedura cinetica:
In ciascuna seduta analitica, dopo aver portato i reagenti alla temperatura di lavoro, bisogna preparare per prima cosa il bianco reagente e uno standard (o calibratore), a titolo noto. Si procede prendendo:
➔ 1000µl del secondo reagente (R2, che corrisponde a un tampone acetato a pH 4.8,
con aggiunta di conservanti e stabilizzanti),
➔ 10µl del primo reagente (R1, ossia una miscela cromogena, ammina aromatica
sostituita),
➔ 10µl di calibratore (per fare il primo passaggio) o del campione (per fare poi i passaggi successivi).
Le soluzioni così preparate nelle apposite cuvette di lettura, vanno mescolate delicatamente e lasciate a incubare a 37°C per 180 secondi. Terminata l’incubazione, si alloggiano nella cella fotometrica termostatata e si eseguono letture ai tempi 0-60-120 secondi al fine di calcolare Δ Abs al primo e al secondo minuto. I risultati dei test saranno espressi in Unità Carratelli (U CARR), applicando la seguente formula:
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(Δ / ) [calibratore]
dove: (ΔAbs / min) sono le differenze medie dei valori di assorbanza misurati ai tempi 0- 60-120 secondi; e [calibratore] è la concentrazione del calibratore (riportata sulla sua etichetta) (Diacron International® Labs. S.r.l. Grosseto, Italia).
7.6.2 BAP test
Il BAP (Biological Antioxidant Potential) test si basa sulla capacità che ha una soluzione di ioni ferrici (Fe3+) complessati ad un particolare cromogeno (e quindi colorata), di decolorarsi allorché gli ioni Fe3+ sono ridotti a ioni ferrosi (Fe2+), come accade, per esempio, se si aggiunge ad essa un adeguato sistema riducente, ossia antiossidante, quale il plasma o siero (Diacron International® Labs. S.r.l. Grosseto, Italia). Nel BAP test, pertanto, il campione viene disciolto in una soluzione colorata precedentemente ottenuta miscelando una soluzione di cloruro ferrico con un particolare cromogeno (una soluzione tiocianato derivata). Dopo un’incubazione di 5 minuti si avrà una decolorazione, la cui intensità è misurata fotometricamente a 505nm ed è proporzionale alla capacità del plasma di ridurre, nell’intervallo considerato, gli ioni ferrici inizialmente presenti, responsabili della formazione del complesso cromatico. I risultati sono espressi come μmol/L o ioni ferrici ridotti (Pasquini et al., 2007; Benzie & Strain, 1996).
Procedura:
Dopo aver portato i reagenti alla temperatura di lavoro, si preparano il bianco reagente, il campione e il calibratore, secondo le quantità sotto riportate:
➔ 1000 µl del primo reagente (R1, una miscela cromogena a base di tiocianato)
➔ 50µl del secondo reagente (R2, ossia una soluzione di cloruro ferrico, FeCl3)
➔ 10µl di H2O distillata
➔ 10µl di calibratore (per fare il primo passaggio) o del campione (per fare poi i passaggi successivi).
Le soluzioni così preparate vanno mescolate delicatamente e lasciate a incubare a 37°C per 5 minuti nel termostato e al riparo dalla luce. Terminata l’incubazione, esse vanno sottoposte a lettura fotometrica, misurando l’assorbanza a 505nm, dopo aver azzerato con acqua distillata. I risultati del test, ovvero il potere antiossidante ferro-riducente del campione, sono espressi in μmol di antiossidanti riducenti il ferro ferrico per L di campione, secondo la formula:
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[Abs bianco reagente $ Abs campione]
[Abs bianco reagente $ Abs calibratore] [calibratore]
dove: [Abs] sono i valori di assorbanza delle soluzioni misurati a 505nm; e [calibratore] è la concentrazione del calibratore espressa in μmol/L (Diacron International® Labs. S.r.l. Grosseto, IT).
7.6.3 OSI
Dai valori estrapolati dai due test precedenti si ottiene l’OSI (Oxidative Stress Index), attraverso la formula:
OSI = d$ROMs
%&' 100 (Tsuzuki et al., 2016).
Dato che lo stress ossidativo si ha quando il rapporto tra radicali liberi e antiossidanti è a favore dei ROS, è importante valutare il grado di stress ossidativo usando l’OSI, che indica l’equilibrio tra i due fattori (Tsuzuki et al., 2016; Po et al., 2013).
7.6.4 Interpretazione dei risultati e affidabilità dei test
Gli intervalli di riferimento per il d-ROMs e il BAP test sono rispettivamente 67.1– 91.5CARR U e 2069–2554μmol/L
(Pasquini et al., 2010). I risultati delle prove di
linearità, precisione ed accuratezza dimostrano che entrambi i test mostrano da buone ad eccellenti prestazioni analitiche. La possibilità di misurare lo stress ossidativo in vivo con prove semplici, economiche e precise, quali d-ROMs test e BAP test, offre ai veterinari uno strumento molto adatto per monitorare lo stress ossidativo e per fare una scelta corretta su eventuali integrazioni antiossidanti nelle malattie che sono comprovate essere correlate allo stress ossidativo negli animali e in particolare nei cani (Pasquini et al., 2007). Inoltre, ottenuti i valori di d-ROMs e BAP, si ricava l’OSI, e un indice alto indica elevato stress ossidativo (Tsuzuki et al., 2016).7.6.5 Spettrofotometro Slim
Lo Slim è un macchinario prodotto, nel 1999, dalla ditta SEAC srl, di Calenzano (FI), IT. Esso è un fotometro per chimica clinica, di dimensioni contenute ed adatto a tutti i laboratori. Tale strumento segue letture di reazione end point, cinetiche, fixed time, multistandard e differenziali, in assorbanza ed in concentrazione, con standard o K factor. Vanta di 199 metodiche in memoria, con possibilità di programmare, per ciascuna, il tipo
85 di reazione, lunghezza d’onda, temperatura, unità di misura, valori di normalità, volume di liquido aspirato, tempi d’incubazione ed intervalli di misura. Tutte le sue funzioni sono controllate da un microprocessore con memoria flash, così che si ha un valutatore elettivo di radicali liberi con un sistema analitico integrato. Il macchinario è, inoltre, dotato di display a cristalli liquidi per le operazioni di programmazione, vano porta cuvette per termostatazione dei campioni, tastiera alfanumerica per inserire i dati e scegliere le impostazioni, vano di lettura per la misura dei campioni e stampante grafica per dati e curve. Si tratta di sistema aperto a tutti gli esami di fotometria su siero, plasma e sangue intero. Su questo macchinario è possibile svolgere numerosi test, tra i quali il d-ROMs test, il BAP test, ma anche l’OXY-adsorbent test e l’SHp test (Diacron International® Labs. S.r.l. Grosseto, IT).
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