Questa classe di proteine, classificate come fluorophore ligation‐ assisted rhodopsin eFRET (FlareFRET), consiste nell’impiego di differenti tinture sensibili a diverse lunghezze d’onda e soggette a
47 ASAP1 fa parte della prima generazione VSD-based GEVI, ha un picco ΔF/F
0 di -23% a fronte di un AP.
Figura 19
~ 54 ~
rapide cineti che . Lo studi o [98] è partito da una fusi one (Ace‐L1) di un l igando accett ore pepti de (LAP) nel prim o l oop dell a rodopsina Ace, esposta all’ambiente extracellulare; poiché i reagenti (le tinture) non s ono perm eabili all a m embrana cell ulare, essi perm ett ono un imagi ng dell a s ol a s uperfi cie cel lul are. Tra l e divers e com bi nazioni di tinture ed Ace, la prot eina Ace‐L1‐ Cy3 (Fi gura 20. A) si è dimost rata l a pi ù performant e a front e di impulsi otti ci (λ = 561 nm) in t ermini di vari azione di fl uorescenza ( ΔF/ F: -35.9±0.8 %) ed accurat ezza t em poral e ( τ=0.92±0.03 m s per depolari zzazione;
τ=1.41±0.04 ms per iperpolarizzazione), rispetto alle altre
alt ernat ive GEVIs (Ace2N -2AA -m Neon in Fi gura 20 .B)
Questi risultati, però, sono st ati effettuati su una colt ura di neuroni, perciò si dovrà att endere che il t eam di tal e studio utili zzi queste prot ei ne in vi vo .
Figura 20
Angewandte Chemie International Edition - Hybrid Indicators for Fast and Sensitive Voltage Imaging
~ 55 ~
I mezzi utilizzati
Esist ono di versi approcci per ins eri re i geni che codi fi cano l e prot ei ne precedentement e el encat e, ma la s celt a dell ’ approcci o dipende fortem ente dall a funzione che dovrà svolgere l a det erminat a prot ei na espress a nel l a cellul a.
I fat tori che i nfl uenzano l’efficaci a dell ’espress ione t rans geni ca s ono il numero di copie di transgeni per cellul a, l a scelt a del promotore o la sequenza di inserzione, l’uso del codone, la presenza/assenza di introni e s e l a prot ei na che il gene deve esprim ere è di m embrana o è solubile [99]. Tali fat tori s ono cruci al i per il ti po di gene da introdurre e ci as cuno di essi ri chie de differenti l ivelli di espressione per ot tenere gli effet ti desiderati.
Per es em pio, nel caso di ChR s, canali ioni ci in genere a bas sa condutt anza, è neces sario un gran num ero di quest e prot eine es press e sull a m embrana per poter propagare in m ani era conti gua l a stimolazione indotta dall’impulso luminoso ; perciò servono vettori virali che int roduc ano copi e mult iple di tal e t ransgen e; contrariam ente, i n caso di un enzima che è attiv o i n bas se concent razioni e che si ngolarm ente p uò alterare l’intero funzionamento dell a cellul a , deve es pressa i n m aniera di gran lunga minore.
Gli approcci general ment e utili zzati per l a t rans genesi sono: il gene- deli vering, ovvero l ’us o di vettori viral i e non vi rali in caso di approccio chi mico; elett rop orazione, fotoporazione , mi croini ezioni e magnet ofezione per un approccio fisi co [99] . Quelli più uti lizzati nel campo dell’optogenetica sono [100]:
Elettroporazione
Tramit e una li eve scari ca el ett ri ca operat a in una cuvet ta, l a membrana plasmatica s i apre sim ult aneam ent e i n num erosi punti, perm ett endo all e m olecol e ed al m at erial e genetico di penet rare. Solitam ente, i n opt ogenetica, quest a t ecni ca viene applicat a solo nell a fas e embrional e di pi ccoli m ammi feri come i topi [100], nei cui cervelli vengono int rodotti plasmidi48 quando sono ancora in ut ero e
~ 56 ~
che, di s eguito, vengono guidati trami te s timol azioni elet tri che. Quest a t ecni ca ha il vant aggi o di essere rapida, s empl ice ed economica; inol tre, consent e di usare pl asmi di con un payl oad di mat eri al e geneti co quantit ativam e nt e m aggiore rispett o ai vett ori virali convenzionali.
È bene sott olineare, però, che non t utt e le zone anat omi che sono indagabili con quest a tecnica e, cons iderando che i plasmidi non si integrano nel DNA ospit e, essi si perdono durante l a di visione mitoti ca; perci ò i neuroni form at asi al moment o dell ’elettroporazione conterranno i pl as mi di per tut to il cicl o vital e, mentre gli alt ri no.
Vettori virali
Esist ono due cat egorie di vett ori vi rali , ovvero vett ori vi rali RNA - bas ed e DNA -bas ed; la s celt a dell ’uno o dell’alt ro d ipende dall o studi o che si vuol e affront are. Ment re i primi ris ultano ut ili per un uso t emporaneo, in quanto espressi rapi dam ent e perché gi à pronti all’uso come se fossero dei farmaci , i secondi si integrano nel genoma dell’ospite in maniera permanente e stabile, come se fossero dei geni già presenti prima dell’applicazione . Tra quest’ultimi, i più utilizzati incl udono gl i adeno -ass oci ati virus ( AAV): pot ent i mezzi per espressi one di t rans gene si che, i n assenza di vi rus hel per co-i nfett anti (AdenoVirus) , s ono difetti vi, ci oè non sono in grado di repl icars i . Grazie a quest a peculiarit à, non si reali zzano succes sive infezioni indesiderat e e, grazie all’azione di proteine ricombi nasi R ep , gli AAV si int egrano nel genom a del l’ospit e in m ani era sito specifica . Alcuni li miti associ ati a quest o approccio s ono i ri schi, s eppur minimi, di carcinogen icit à, di t ropism o49 e di immunogenecit à [100]. Inol tre, per le ridot t e dimensioni dei vet tori vi rali, i loro payload sono pi uttosto inferiori ri spetto a quelli non vi rali e l a loro produzione ri sent e di diffi colt à tecniche legate ai t empi di fabbri cazione . Nonos tant e ciò, i vi rus, essendo frutto dell ’evol uzi one di mili ardi di anni , sono est rem ament e efficienti per quanto ri guard a il gene-deliveri ng i n mi rat i organi smi e s ono oggett i di continue ricerche per aument ar ne l a si curezza e selezionarne l e speci fi cit à; a
~ 57 ~
dimost razi one di ciò, sono già att ivi t ri al cli nici su terapi e geniche, che coinvolgono l’uso di vettori virali, in particolare AAVs [101].
Vettori sintetici
Esist ono num erosi vettori non vi rali che negli ult imi anni hanno dimost rato di pos sedere enormi pot enzi al i per il gene-deliveri ng e di cost itui re vali de alt ernative ai vettori virali , ove quest ’ulti mi non poss ono ess ere appli cabili [102] . Tra questi vettori , risul tano degni di not a i liposom i, i polim eri e l e nanoparti cel le . Quest e ult i me s ono sempre più i ngegnerizzat e, al punto d a ess ere nominat e int elligent NPs (Fi gura 2 1), per vi a del la si nergi a che si inst aura tra l a part e inorgani ca (com e nanoparti cell e di oro, os sidi di ferro e quant um dots (QDs ) che fornis cono propri et à otti che, el ettriche e magneti che) e quella organi ca (com e cat ene polim eri che, a cui si l egano recettori e plas midi ) [12] . Tendenzialment e, i NPs hanno minore immunogeni cit à, m aggiore payload e sono più economi ci e semplici da fabbri care. Tutt avia, la loro effi caci a non è s empre paragonabil e a quella dei vett ori vi ral i; persistono ancora, infatti, divers e diffi colt à tecniche , quali l a degradazione del m at eriale genetico d a part e di agenti est erni , com e m acrofagi o erit rociti nel mezzo ext racell ulare [100] , e la compromi ssi one del flus so sanguigno dovut a all a pres enza d ei vett ori st es si, che può indurre inibi zi on e nei siti in cui quei vett ori dovrebbero andare a l egarsi per ril asci are mat eri al e genetico .
Figura 21
Frontiers in Bioengineering and Biotechnology - At the Intersection of Biomaterials and Gene Therapy: Progress in Non-viral Delivery of Nucleic Acids
~ 58 ~