La fotochimi ca, che vanta un s ettore sci entifi co ris ale nt e all ’epoca indus tri al e e qui ndi pioni ere di i nnumerevoli st udi , è uno dei possibili approcci con cui si poss ono cont roll are , tramit e la luce, le attività nervose. È, però, merito d el progress o tecnologic o degli ultimi decenni , s oprattutt o i n rel azione all a mi croscopi a laser 2P [31] , s e la fotochimi ca ha guadagnat o il ri conos cim ent o di cui oggi gode nel campo dell a sti mol azione ott ica .
Ess a, i nfatt i, cons ente di alt erare t ram it e l uce, con una ris ol uzi one spazi al e m ai raggiunta i n passato, le st rut ture di m olecole chi miche, che hanno dimensi oni inferiori di diversi ordi ni di grandezza rispetto a quelle dell e protei ne o dell e cellule.
Pochi sono gli st udi rel ativi all e neuros ci enze che fanno us o di questo approccio fotochim ico ricorrendo ai complessi photoswit ch -li gando; la m aggior part e degli st udi, invece, prevede il ri corso a neurot rasm ettit ori caged fotoattivabi li per i diversi int rinseci aspet ti vantaggiosi .
Innanzit utto, i caged fotoatt ivabili non ri chie dono al cuna espressione genica es ogena e, quindi, nessuna t erapia geni ca .
Nonost ant e ci ò, consent ono di st udi are , mappare e m ani pol are le connessioni funzionali dell e si napsi con una precisi one spazi ale e temporal e non paragonabil e a quel la degli alt ri approcci, optogeneti ca compresa ; è poss ibil e regol are i pot enzi ali a livello di singola si napsi da rem oto anche dopo diverso t empo dall ’introduzione d ei neurot rasmettitori caged , per m eri to anche degli svil uppi dell a mi cros copia l as er 2P. Grazie al la not evole m odell abili tà dell e gabbi e, l a loro ingegnerizzazione è un s ettore in conti nuo ri nnovamento ed ogni anno vengono pubbli cati num erosi st udi i n m eri t o. P er di più, l ’avvento degli idrogel [36] ha perm ess o di ingegnerizzare gabbie biodegradabili e biocom pati bili , il che ha reso questo sett ore di ricerca molto più att raente di quanto non lo fosse una decina di anni fa.
Un ult eriore motivo che giusti fica questa continua ingegnerizzazione è l’int eres se che ess a susci ta anche i n al tri sett ori di ricerca che si
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occupano del drug -delivery, si a a l ivello universit ari o che di azi ende farm aceuti che.
Bisogna consi derare , però, che q uesta m etodol ogi a di approcci o, pur meno invasi v a ris pet to all e alt re propost e in quest o lavoro , comporta conseguenze irreversibi li del phot o-uncaging; può produrre sottoprodott i da smaltire ; i n caso di fot olisi ripetut e o prolungate, aum ent a il ri schio d i es aurimento local e del glut amm at o caged e, quindi, l a neces sità di c ontinu e perfusi oni di questi neurot rasm ettit ori .
In altre parol e, ques to approcci o non è consigli abile se s i devono applicare treni di im pulsi l uminosi ad alt e frequenze [13], el ementi
chi ave dell a neurost imol azione.
Attualm ent e, l e gabbie più utili zzat e e commerci ali zzate s ono CNB - e MNI-caged , m a è noto che l a loro sint esi è pi uttosto impegnativa [29].
Inoltre, c’è da sottolineare che la maggior parte di queste gabbie contiene neurot ras mettit ori gl ut amm at o. Diversi studi, infatti , evi denzi ano la diffi colt à di ingegnerizzare gabbie che cont engano neurot rasm ettit ori di fferenti dal glut amm ato , i n parti col are GABA, perché si pres ent ano spess o inst abilit à chi miche e comportam ent i ant agonist i prim a che avvenga l a fot olisi dell a gabbi a [34] [47]. In alt ernativa ai neurot rasm ettitori caged , si possono coi nvol gere i PTLs, che sott o certi aspetti sono vantaggi osi e m eno invasi vi ri spet to all e prat iche optogeneti che. S e bbene ques t’ulti me offrano st andard di sicurezza e di efficaci a m aggiori in caso di m odi fiche geneti che , i photoswi tches, com e LiGl uR , Zi api n2 e NanoP arti cl es (NPs ), meritano comunque l’attenzione da parte della comunità scientifica , perché cons ent ono di studiare reti neural i da un punt o di vista differente rispetto a quello dell’optogenetica .
I LiGl uRs, infatti , s ono capaci di i nnes care APs ad alt e frequenze [42] a parti re da una singola si napsi di una spi na dendriti ca; ci ò las ci a presupporre a chi scrive che , potenzi alm ent e, int roducendo prot ein e volt aggi o s ensi ng, come i GEVIs, c i si a la possi bilit à di osservar e e tracci are l a propagazione di segnali nervosi i n int ere reti neurali :
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dall’inizio, dove sono posti i photoswitches, alla fine con alta risol uzione t em poral e e s pazi al e.
Un recent e s tudi o [48] ha svil uppato un PAL piuttost o different e e d innovati vo rispett o a quelli già esistent i ed ai P TLs : senza alcuna modifica genetica e da una versione ingegnerizzata dell’azobenzene, si è ottenut o un anfifilico24 azobenzene photoswi tch, denom inat o Ziapin2.
Questo si int erpone t ra le estremit à dell a membrana cel lul are (Figura 11A) e, fotoi som erizzandosi (λp e a k~470 nm), si rest rin ge (Fi gura 1 1B)
provocando un dist anzi am ent o t ra l e est remit à del la m embrana e, di conseguenza, riducendone la capacit anza25.
Ciò com port a robust e vari azioni di pot enzi ali tra -60m V e -30mV i n una scal a t emporal e compresa t ra il ps ed il ns; quindi , Zi apin2 i nduce rapidi ssim e i perpolarizzazioni .
Per contro, u n completo ril assam ent o termico al buio per rit ornare dal cis -st at e allo t rans-s tat e, nel qual e si rist abil is ce l a capacitanza di m embrana ai livel li pre -st imolo , i mpi ega ci rca 108 s. Zi api n2 ha mostrat o l a st ess a effi cacia si a in vitr o, in una cult ura di neuroni ippocampali, che in vi vo, nell a cortecci a somatos ens orial e murino .
24 Una molecola anfifilica possiede sia un gruppo idrofilo sia uno idrofobo. Ne sono esempi i fosfolipidi [23]. 25 La capacitanza di membrana è l’analogo elettrico della capacità. È espressa come
𝜀 𝐴 𝑑⁄ [F]; ε = dielettricità del materiale contenuta tra le due superfici, A = area superficiale, d = distanza tra le due superfici
Figura 11
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Optogenetica
“The development of optogenetics cleanly splits neurosci ence, and m any ot her branches of sci ence, i nt o pre -
and post -opt ogenet i c e ras.”
Sheena A. Jossel yn
L’optogenetica è una tecnica scoperta nel 2002 da Miesenböck e dal suo t eam e considerat a “M ethod of the year 2010 ” dall a rivist a speci ali zzat a Nat ure Methods. [49]. Successivam ent e , alt ri s cienzi at i di spi cco com e quelli del Dei ss eroth’s lab , con i quali hanno coll aborat o anche Ed Boyden, Feng Zhang (uno degli i nventori del la tecni ca C R ISPR -C as), Ernst B am berg e Georg Nagel, hanno com preso l e ul teriori pot enzi alit à d i quest a t ecni ca , cui hanno dat o il nome di “optogenetica” [50].
L’optogenetica, frutto di una interdisciplinarietà di studi di settore, quali l a geneti ca, l a biologia, l ’opt oelet troni ca e l a bioingegneria, ha consentito un rapido sviluppo del l’imaging otti co e del t argeting geneti co di speci fi ci tipi di cell ul e ; i n parti col are, l ’appli cazi one di questa t ecnol ogi a ai neuroni ha res o possibi le vi suali zzare e mani pol are ci rcuiti neurali in vivo.
Tale tecnica consiste nell’introduzione di geni, solitamente di origine nat urali a cui vengono poi apport ate dell e mut azioni , att ravers o differenti approcci , che codi fi cano opsine, prot eine s ens i bili a determinate lunghezze d’onda della radiazione luminosa (in parti col are a bande dell o s pettro del vis ibile ) e prot eine vol taggio - dipend enti fl uorescenti , l e quali , proprio grazi e all a loro fluores cenza, perm ettono di essere i ndivi duate fornendo così informazioni circa l’intensità del potenziale di membrana.
L’optogenetica ha riscosso in breve tempo grande successo e d è, a tutt’oggi, un’indispensabile pratica in molti laboratori di ricerca, soprat tutto del le neurosci enze; ci ò è dovuto non t ant o al la possibilit à di stimol azione nervosa che offre, quant o alla possi bilit à di i nnescare o inibire potenziali d’azione nei neuroni con una risoluzione spaziale pari a quella cell ulare e con scal e tem poral i dell'ordine d el
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millis econd o26 [51], cons ent endo l a comprensi one dell a funzione di
num erosi ci rcuiti neurali i n vivo e di fenom eni pat ologici , oltre a dimost rare i nes attezze di precedenti t eori e neuros ci enti fi che, come la confutazione del ruolo svolto dall’area MPA [52]
[1] La pubbl icazione di eminenti arti coli rel ativi agli st udi di optogeneti ca ha cons entit o :
• la comprensione del fatto che stati comportamentali complessi , com e ansi et à e depressione, em ergono da piccoli t ratti di st ati indivi duali fisi ologici 27 e dai circui ti neurali ad essi sottos tanti . [53]
• l’identificazione di gruppi di engrammi 28 , i n parti colare
dell’ippocampo [54], e lo stretto rapporto che intercorre tra loro e l’attività mnemonica in quegli stessi neuroni ; gli engrammi s ono , infat ti, in grado di controllare l’i ntegrazione e la s eparazi one dell e memori e [55]
• una maggiore comprensione del ruolo dei ritmi theta 29
nell’ippocampo, responsabili della codifica e decodifica della memori a [56];
• la dimostrazione dell’esistenza di specifici circuiti neurali su cui si basa la sopravvivenza dell’individuo: sonno, fame, sete, respi razi one, ritmo ci rcandi ano, bil ancio energetico ed istinto di di fesa sono regol ati propri o da s peci fic h e mappe neurali [57];
• la determinazione di pattern di azioni motorie controllate da speci fi che cellul e e ci rcuiti neurali , i quali ne regolano il funzionamento o il disfunzi onam ent o, favorendo la com prens ione di alcune malat tie neurodegenerati ve com e il Parkins on [58];
• la scoperta dei circuiti neurali della ricompensa nell’area ventral e t egm ent al e (VTA) : sono stati individuat i , infatti, nel mes encefalo i neuroni responsabili del ril ascio di dopamina che
26 Sono tempi necessari ai neuroni per elaborare e scambiare informazioni con altri neuroni 27 Per esempio cambiamento del ritmo respiratorio, temperatura corporea, pressione sanguigna, etc. 28 Mappe neurali o tracce mnemoniche neurobiologiche che si “depositano” nel sistema nervoso sotto forma
di variazioni biochimiche e biofisiche a seguito di apprendimento e di esperienze.
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det erminano il s egnal e di ricompens a, a parti re dal s empli ce condi zionam ent o di Pavlov [59], fi no all e più compl es s e strat egi e di apprendi ment o [60];
• l’individuazione delle precise mappe neurali che regolano i com portam enti soci ali anim ali , compres i l’accoppi am ento e l’aggressività; tali mappe erano molto difficili da individuare, perché collocat e nell e profondit à del cervello [61].
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Le opsine
La maggioranza dei geni utilizzati nell’optogenetica è di origine microbi al e; si tratt a di op sine che codifi cano prot eine fotos ensibili che s ono st at e t rovat e princi palment e negli archea e nei batteri. Ogni proteina opsina richiede l’incorporazione di un retinale, o aldeide dell a vitamina A, una dell e t ante vari anti di vit ami na A , che vari a da s peci e a speci e ; è un importante cromoforo , che forni sce poi al compl es so opsina -ret inale l a s ensibili t à al la l uce ; t al e com ples so cost ituis ce l a base chimica dell a vi sta ed è nomi nat o rodops ina . Quando l a rodopsina as sorbe un i mpul so di luce di una det erminat a lunghezza d’onda, il retinale cromoforo isomerizza l’intero com plesso ed attua una seri e di cam biam enti st rutturali che guidano il trasporto ionico, l’apertura dei canali o le interazioni con proteine trasduttori di s egnali [62].
I geni dell e opsine s ono divisi in due super famigl ie , mol to differenti nell e sequenze geneti che , nel m eccani smo e nell e funzi onalit à : opsin e microbi ali (t ype I) ed opsine anim ali (t ype II). [63]
I geni delle opsine Type I sono st ati trovati i n procarioti , alghe e funghi e cont rol lano diverse funzioni tra le quali il m oviment o fototat tico, il depos ito di energia, l o sviluppo e la bi osint esi di ret inali [64]. Quando i retinali vengono attivati dall a l uce, ess i rim angono associ ati con l e opsine con un legame coval ente ed invert ono t ermi cam ente gl i st ati al l -t rans; questo fenom eno è , però, perfett am ent e reversi bile ed è anche m olt o rapi do30.
30 Per tale ragione, queste rodopsine sono considerate potenti strumenti largamente usati nell’optogenetica, in
particolare nel campo delle neuroscienze, proprio per modulare le attività nervose ad alte frequenze [175] [51].
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Invece, le opsi ne t ype II si trovano s olo negli eucari oti e sono respons abili dell a vi sione. Inolt re, una piccol a part e di ess e svolg e importanti ruoli nel ritm o ci rcandi ano e nella regol azi one dei pigm enti [65].
Le opsi ne type II consist ono fondament alm ent e i n recettori accoppi ati all e proteine G (GPCR s), perci ò, quando vengono illuminat e, si reali zzano dell e i som erizzazi oni ed i nt erazioni t ra prot ei ne che provocano una cas cat a di m olecol e mess aggere ; queste ultim e t rasm ett ono s egnali biochimi ci , che andranno a tras durre al tr e prot ei ne .
Al cont rari o de i ret inali delle rodopsine type I, questi reti nali s i dissoci ano dall e ops ine II dopo l’i som erizzazione provocat a dal la luce; perciò si t ratt a di un processo i rreversibil e e, a caus a dell e cascat e di molecol e mess aggere , gli effetti cell ulari cambiano con una cineti ca più l enta rispetto all a ci neti ca che caratt eri zza l e rodopsi ne type I31.
Le opsi ne mi crobi ali (type I) rim angono , com unque , l e pi ù ut i lizzate per l e seguenti ragi oni: dipendono da un uni co gene compatto (e quindi facil e da i nt rodurre nel genom a cellul are) res ponsabil e del la loro sensibi lità all a l uce e dei relat ivi effetti; in as senza di l uce, non vi è rispost a alcuna; l e ri sposte avvengono con int ensit à e con lunghezze d’onda della luce ben tollerate e con scale temporali del millis econdo.
Le funzioni svolt e dall e opsine us at e nell’opt ogeneti ca so no: depol ari zzazi one ed iperpolari zzazione in pres enza di luce, photosensing, fluorescenza i n presenza di pot enzi ali di m embrana. Quest e opsine comprendono: