Un’altra teoria sugli effetti del INS [111] [125], complementare a quella precedent e, s osti ene che l a variazione di t emperat ura cambi a la condutt anza di vari canal i ionici . È noto che molti di quest i sono sensibili all a t em peratura, ma quell o che merita att enzione è l a cl ass e dei canali TRPV, per vi a del la loro termos ensibil ità. È molto probabil e, infat ti, che INS abbi a effetti eccit atori sui lipi di dell a membrana e sul le molecol e d’acqua l e quali acquisi scono un’energi a radi ant e signifi cant e e, di conseguen za, vanno ad influenzare in mani era m arcat a l e attività dei canali TRPV e di alt ri component i cellul ari t ermos ens ibili.
Lo st udio [126] rifl et te l ’import anza del ruolo di ques ti canal i TRPV nell a neurostimol azi one, perché, i nfatti , topi TRPV knock -out, a
54 I doppi condensatori appartengono alla classe dei supercondensatori, le quali sono caratterizzati da due
doppi strati elettrici (ciascuno si compone di un interfaccia tra un elettrodo ed un elettrolita allo stato liquido, separati un sottile strato che fa da dielettrico). Questo sistema può essere paragonato ad una serie di due condensatori.
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front e di impulsi IR ( λ = 1.85 -1.87 μm ), non m ost rano ri spost e nervose .
Un’altra teoria sempre più accreditata e supportata da numerosi studi, sosti ene che INS st imoli pri ncipalm ent e cromofori mitocondri ali (cytochrom e c oxi dase), poiché es si subi scono cambi am enti t erm ici anche a t emperat ure inferiori a 43°C; quest e proteine, s ensi bili in parti col ar modo al NIR ( λ = 810 nm ), sono int erpost e nelle m em brane dei m itocondri e vengono stimolat e con l a conseguent e g enerazione di s peci e reattive oss igeno (R OS), com e il monossi do di azot o55 (NO) [127] [128] [129] (Fi gura 24 ).
A l oro volt a, vanno ad influenzare int eri proces si biol ogi ci [110] [111] [130] , com e la produzi one di ATP, l a ri organi zzazi one citoscheletrica, l’omeostasi e la proliferazione e la differenzazione . Va specifi cato che l e dosi di radicali li beri e R OS devono ess ere mant enut e bass e, per evit are il danneggi ament o di o rganel li e cellul e ed il conseguent e photoaging e phot ocarcinogenesi s [111] .
In bas e a tutt o ci ò , quindi, è pos sibil e s ostenere che, i n general e, l’effetto primario dell’irraggiamento con cui si realizza INS, è l’eccitazione delle molecole dell’acqua, in particolare quelle intracel lul ar i, che acquis iscono accel erat i m oti vibrazi onali che vanno ad i nfl uire s ull e conform azi oni di enzimi , canali ioni ci ed alt re prot ei ne. Inolt re, elevat i gradi enti t ermi ci risultano ess ere el ementi chi ave nel la neurost i molazione IR [14].
In aggiunta, conoscendo quest e caratt eristiche, olt re all a t eori a fisi ca dell a l uce, è possibi l e ricorrere a m odelli mat em ati ci per descrivere
55 In biologia, è un importante neurotrasmettitore con effetto vasodilatante
Figura 24
Journal of Photochemistry and Photobiology - Biological effects and medical applications of infrared radiation
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il com port amento d ei fotoni che int eragiscono con i t ess uti; es si poss ono, infatti, es sere assorbi ti o deviati si a el asti cam ente che anel asti cament e . Modelli di INS ri corrono spes so al l’uso del metodo Mont e C arlo, che cons ent e capace di simulare processi fi s ici i n mani era s tocasti ca e che perm ett e di determinare l a dist ri buzi one spazi al e dell a luce assorbit a nei t essuti, grazie al la qual e è possibi le investigare il comport am ento t emporal e del flusso di calore, i n funzione dell’energia di esposizione radiante , la dimensione della fibra, la l unghezza d’onda, l a geom et ria del bers agl io ed alt ri paramet ri [122] [131] [132] . Questi modelli ad elem ent i finiti perm ett erebbero di risolvere equazioni del cal ore e fornire anali si dett agl iat e in m ani era precisa us ando im pulsi ms o µs , in m olti dei tessuti nervosi ogget ti di studio . Un esempio è il model lo t rans port in multi-layered ti ssues (MC ML) [133], che approfondi sce l e interazi oni tessut o -radi azione.
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Stimolazione
La neuros timol azione otti ca m ediat a da radiazione i nfraross a dipende innanzitutt o dal tipo di tessuto nervoso che si st a considerando: i tessuti corti cali , ad esem pio, present ano profonde differenze si a anatomi che che funzionali rispetto ai t ess uti nervosi peri ferici, e, quindi, l’uso del IR può avere effetti ass ai diversificati su questi due tessuti.
Sono stati ottenuti num erosi risult ati nel cors o degli anni, ma l a neurostimol azione ottica appli cat a alle vie udi tive, o megl io, ai neuroni SGNs rim ane quell a che ha most rat o esiti più s oddi sfacenti [134]; in pi ù è stato ris cont rat o che in quest i si ti s i innescano AP s tramite impulsi dell’ordine del nanosecondo senza un minimo di effetti collaterali [135] .
È chi aro, quindi, che la sti mol azione ed i suoi effet ti sui tess uti dipendono fort em ente dai param et ri stessi dell a radiazione el ettrom agneti ca e quest i sono ottimi zzat i in funzi one di cos a si va a stimol are. Per es empio, paramet ri IR che consentono l a s timol azion e di motoneuroni m olto probabilm ente non potrebbero ess ere alt ret tanto vali di paramet ri per l a stimol azione di neuroni appart enenti al le cort ecce s ensori ali, visi ve e cos ì vi a. Quindi è molto important e ini zi are un l avoro m antenendo l’att enzi one sul tipo di neurone che si vuole studi are e, com unque, gli st udi effettuati sono ancora carenti , se si pensa che con lunghezze d’onda differenti, si potrebbero ott enere effetti compl et am ent e opposti.
È s tat o ri scont rato , i nfatti, i n num erosi studi che es porre i neuroni con radi azioni el ett romagneti c h e con lunghezze d’onda inferiori a quella del rosso (λ<600 nm), aumenta la soglia di stimolazione e riduce m aggiorm ent e int ensit à e frequenza dei pot enzi ali [5] [123]. D’altra parte, anche una banda ristretta del NIR intorno ai 1000-1100 nm, provoca una di minuzione di i ntensi tà dell e ris post e nervos e nei tessuti sia del SNC che del SNP ; anzi, all’aum ent are dell e energi e emesse, l’ampiezza del potenziale d’azione composto (CAP) diminui sce e, cont emporaneam ent e l a temperatura delle cellul e raggiunge i 60°C, con evidenti danni.
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Quindi gli autori di quest i studi hanno concluso che l ungo l o spett ro el ettrom agneti co, ci sono diversi pi cchi in cui l a radiazi one è i n grado di bloccare la propagazione di APs attraverso l’area irradiat a del nervo m ammi fero [5] [136].
Infine, il range ottim al e e si curo per una neurost imol azione effi ci ent e è 1450-1880 nm , i n part icolare le due λ = 1450nm e 1875nm [9] [137] , per l a cui stimolazione sono suffi cienti bass e s ogli e. M a l a s celt a del λ da usare precisamente dipende sempre dal tipo di neurone, dalla dimensione spot e, in particolare dall’energia radiante coinvolta. Oltre a ciò, es ami istologici hanno evi denzi at o che i val ori dell’energia radiante affinchè i tessuti si danneggino , devono essere maggiori di diversi ordini di grandezza ri spet to ai val ori s ogli a della neurostimol azione.
Ciò è valido anche per l’esposi zione radi ant e [138] , per la qual e l a probabilit à di provocare danni è <1% con val ori di 0.66 –0.70 J/cm2, val ori signi fi cativam ent e s uperi ori rispett o a quelli richi esti per una stimol azione affi dabi le (0.34 –0.48 J/cm2).
Infatti, è stato definito che l’intensità dei danni dipende fortemen te dalla lunghezza d’onda, poiché il coefficiente d’assorbimento è in funzione di ess a; [113] all’aumentare del coefficiente di assorbim ento, è necess ari a minore energi a per l a stim ol azione, tuttavi a, alti coeffi cienti di assorbim ent o si as soci ano a m aggiori ris chi di provocare danni e fenom eni di ablazione dei t es suti .
Dall’altra parte, a fronte di una bassa probabilità di danni, usare impulsi con bassi coeffi ci enti di assorbim ent o det ermina che i neuroni, per depol arizzarsi, necessit ano di m aggiori quant ità di energi e.
Quindi, attraverso prove sperim ent ali it erat ive, si è dimost rato che lunghezze d’onda con mi nimi coeffi cienti di assorbi mento dell ’acqua (µa ~ 3 mm- 1 ) s ono quelle che hanno il miglior rapporto , in termini
di s icurezza, t ra l’energi a ri chi est a per l a stimol azione e l a soglia dei danni [9] [109] .
Dunque, molti autori ritengono che l’energia radiante sia il parametro princi pal e per la neurostimol azione basat a sugl i i nfrarossi: tant o è
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vero che, già i pri mi studi gui dat i da Wells nel 2005, avevano constatat o l ’importanza prim ari a di t ale paramet ro [109].
Va precisato che l’energia radiante e l’esposizione radiante sono due vari abili molt o di fferenti e la letteratura sci entifica non un vali do cri terio sul la qual e bas are la s cel ta tra l e due variabili .
L’energia radiante, in linea di principio, è il valore c orrispondente alla punta della fibra ottica esposta all’aria e, ovviamente, non è lo stesso val ore che s i ris contra s ul bersagl io, di cui ass orbe e devia i fotoni, riducendone il valore dell’energia radiante . Per calcolare l’effettivo valore, è necessario conoscere il coefficiente d’estinzione e la distanza tra l’obiettivo e la punta della fibra ottica , ottenibile medi ant e mi crotomografi a comput eri zzat a a raggi X (mi croC T). Alternativamente, si può invece ricorrere all’esposizione radiante , sebbene, rispetto al precedente, si a pi ù compl ess o conoscerne i l val ore: di fatti, si tratta del rapporto t ra l’energia radi ant e e l’area irradiat a, o dim ensi one spot , di ffici lmente cal col abile in vivo . In teori a, dal di amet ro del nucl eo dell a fibra otti ca, cal col at a dall 'apert ura del la fi bra otti ca in ari a o nei flui di, si ri porta il valore dell a dim ensi one spot t ram ite un im agi ng dotat a di una fot ocamera sensibil e a infraros s i oppure in base a vari azi oni di temperat ura riflesse dall 'irradi azione di i nchios tro termocromi co dis ciolto i n agar. [18]
Per valori dell’energia radiante o esposizione radiante inferiori a quelli di sogli a, si ri teneva che non si pres ent ass e al cun fenomeno, in quanto non si constat ava al cuna vari azione nell e ris post e neurali. In realt à, u n recente studi o [139] è st ato i n grado di mett ere in chi aro la rel azione t ra INS e le at tivit à si napti che, focali zzando l ’attenzione sull a corrente di m embrana su fett e di neuroni proveni enti dal tronco cerebrale murino. Infatti, t al e st udi o ha di mostrat o per l a prim a volt a che, nonost ant e non s iano st ati ri scont rati al cun APs n ei neuroni, INS è in grado com unque di generare rispost e sinap ti che. In pass ato era stat o oss ervato lo st esso fenomeno soltant o su C .elegans [140] m a si rit eneva che l o st esso potesse non verificarsi anche su neuroni mammi feri . Inoltre, lo studio [139] ha utili zzato fi bre ott iche di diam et ro ri dott o (14 µm) e questo com port a che l e superfi ci dei
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neuroni esposti subi scano un’energi a radiante m olto el evat a (261
𝐽
𝑠·𝑐𝑚2 a fronte della massima potenza laser utilizzata: 7.8 mW con λ
~1.89 µm ).
Cont emporaneament e , è s tat o misurat a l a corrente s ui neuroni t ram ite strum enti di misura el ett rofisiol ogi ca v olt age clam p ed è stat o ril evato che INS depol ari zza cost ant em ent e i neuroni (anche pe r tempi di esposizione prol ungati ed all a m assima pot enza), con val ori medi di potenziale di membrana di +4.15 mV ± 2.55 m V e con val ori medi di influss o di corrent e 10.0 pA ± 7.9 pA (Figura 2 5).
Si riport a che l a frequenza con cui si pres ent ano eventi si naptici , dipende si gni fi cativament e dall a pot enza las er utili zzata . In ness un caso, INS ha innes cato A P s.
Questi ri sult ati evidenzi ano che, olt re a non provocare al cun danno, l’esperimento è reversibile; si ipotizza, infine, che INS possa infl uenzare la probabilit à di ril as ci o di neurot rasm et titori , indipendent ement e dall a pres enza o meno di APs.
Confront ando, invece, i primi lavori apport ati s u t es suti nervosi appart enenti al C NS, com e quello del gruppo di C ayce [113] , ed al PNS, com e quello del gruppo di Wells [109] , si è ris contrat o che il prim o, per evocare APs, richiede una soglia di es posi zione radi ant e minore rispett o a quell a del secondo per l a maggior part e dell e lunghezza d’onda.
Le ragioni sono piuttosto prevedibili, in quanto l’anatomia dei due tessuti è alquanto di fferent e: innanzi tutto, i tessuti del C NS che sono
Figura 25
Biomedical Optics Express - In vitro neuronal depolarization and increased synaptic activity induced by infrared neural stimulation
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com posti si a da m at eria grigia56 che m at eri a bianca57, m ent re i t es suti
del P NS sono com pos ti pri mari am ent e da assoni , i cui sono ci rcondati da tes suti connetti vi, che assorbono m olt a radi azione IR.
Quindi, affinch é si i nneschino rispost e nervos e, i secondi richiedono una quantità di energia m aggiore dei prim i e questo spi ega il motivo per cui i t ess uti del CNS hanno una s ogli a di stim ol azi one i nferi ore.
INS nel cervello
Nonost ant e rim angono rel ati vo all a sti m olazione di t ess uti corti cali tramit e l a radi azione infrarossa, quell o condott o dal gruppo di Cayce [113] , è lo studio che funge da riferi ment o per tutti gl i studi post eriori, perché è stat o il pri mo s tudi o val ido in questo am bito di ricerca che ha utili zzando il modell o t al amocorti cale dell a fett a del cervell o murin o. Si t rat ta di un m odello ben st udi ato , ri producibile e com unement e uti lizzato nel settore dell e neurosci enze [141], perché riproduce atti vit à nervos e molt o simi li a quell e ris contrat e negl i studi
in vivo.
Nel lo st udio di C ayce [113], sono st ati confront ati impulsi di differenti l unghezze d’onda (2.51, 3.65, 4.00, 4.40 e 5.30 μm), ciascuna con un’energia radiante variabile al fine di determinare la sogli a di stimolazione. Nonost ant e che nel CNS i norm ali processi neurali siano es eguiti a frequenze molt o el evat e, i n questo studi o, per motivi t ecni ci, s i è ri corso fino a i 30 Hz e si è, com unque, oss ervato che, aumentando l e frequenze di impulsi l as er IR , l a sogli a di energi a radi ant e ri chi est a per l a sti mol azione di minuiva. Si riti ene che , con l’aumentare della frequenza, i neuroni accumulino maggiori quantità di energi a, ovvero ch e al l’arri vo degli i m pulsi s uccessi vi, rim ang ano dell e quantit à di cal ore resi due che vanno a concent rarsi nel corpo cellul are.
Di conseguenza, ciò ridurrebbe l’i nt ensit à dell ’energi a necess aria pe r stimol are i neuroni a front e degli i mpul si successivi . Infatti , si è stimat o che i neuroni del CNS hanno una durat a del rilassam ento termico i nferiore a 1120 ms per l e ti pi che l unghezze d’onda a bass e frequenze (<5 Hz) [138] [113] [142]; al cont rario, per frequenz e
56 Corpi cellulari e dendriti 57 Assoni dotati di guaina mielinica
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tipiche dei process am enti neurali e se si m ant engono l e st ess e ampiezze dell’energia radiante, la durata per ritornare alla temperatura bas eline può raggiungere i 4.5 s.
Inol tre, questo st udio [113] ha mess o i n luce d u e i mport ant i caratt eristi ch e tipi ch e del INS : l a capaci tà di st imol are in m ani era cost ante ed ist ant anea a frequenza fi ssat a (Fi gura 2 6.A) e l a mancanza di artefat ti (Figura 26.B ). Essi, individuati m ediante el ettrodi di regist razione, s ono, infatti, associati ai s egnal i el ett rici em essi da elet trodi di sti mol azione (Fi gura 2 6.C ); perci ò, da questo punto di vist a, INS è una applicazione vant aggi os a rispett o al la convenzional e s timol azione el ett ri ca.
Successivam ent e, in alt r i l avor i condott i dallo stesso Cayce [143] [144] (ent ram bi con λ=1.875 μm) e da alt ri autori [142] (λ = 980 nm) , che si sono avval si del INS su topi e su prim ati non um ani i n vivo , sono st ati ottenuti ri s ultat i pi uttosto differenti ri spetto all a situazione
in vitro .
Ment re i n t utti gli st udi i n vitr o o ex vi vo l a s timol azione infraross a ha indott o i neuroni ad innescare APs, quest i studi, al cont rario , hanno determi nat o che INS induce invece all ’ini bizione nei t ess uti nervosi del CNS per un periodo piutt osto prol ungat o ( 1 - 4.5 s). Da un primo s tudi o di Cayce effettuato su topi in vi vo [143] , viene riport ato infatti che successi vamente ad ogni impul so IR, si verific a un calo si gni fi cat ivo di APs ril evati : nel la Figura 27.C si utili zza solo IR, m entre nel la Fi gura 27.D IR e st im oli s ensoriali che vengono percepiti m a subi to soppressi.
IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics Infrared Neural Stimulation of Thalamocortical Brain Slices
~ 76 ~ Si ritiene che l’origine degli effetti ini bitori s ia dovuto all’attivazione stessa di quei neuroni i nibit ori , in parti col are i dendrit i del le cell ul e piramidali api cali , che sono maggiorment e pres enti negl i strati pi ù est erni dell a cortecci a espost a all a radiazi one, rispett o a quelli ecci tat ori, che i nvece
sono pi ù pres enti negli st rat i più profondi del cervello. Inol tre, gli st rati s uperiori includono el evate concent razi oni di cellul e gli ali, astrociti, oligodendrociti e mi croglia. Diversi autori ritengono che l’attivazione di queste ultime cellule, inducono cambi am enti strutturali , ad esempio, dei vasi s anguigni che al terano, di cons eguenza, l ’emodinami ca, di cui è noto che è st rett am ent e correl at a con l e attività neurali .
A dim ost razi one di quanto detto, u no st udio [145] ha invest igat o l e dinamiche di cal cio intracel lul are in vi vo m edi at a dalla m icroscopia two -photon in ris pos ta degli impulsi IR (λ = 1.875 μm ): t ali s egnali mostravano di vers e componenti , suggerendo che s ono coinvolt e divers e cel lul e e non solo i neuroni . La component e l e nt a del s egnal e calci o era i n real tà quella che si propagava att raverso l a ret e degli ast rociti, m ent re l a componente veloce ed ist ant anea era quell a che si propagava t ra i neuropili58.
Sapendo dall a legge di Beer che l a penetrazione della radi azione el ettrom agneti ca è in funzione dell a lunghezza d’onda, la s tragrande maggioranza dell a radi azione usat a nel INS vi ene as sorbit a dagli strati corti cali I e II, nei quali sono ben presenti gli ast rociti, caratt erizzati da on de l ent e di segnali cal cio, e dendriti api cal i [146]. Inol tre, era gi à not o da precedenti st udi che gli astroci ti sono fotosensibili a lunghezze d’onda tipiche del NIR (800 nm) e che mostrano simili onde lente [147].
58 Regione che include le connessioni sinaptiche tra le ramificazioni assoniche e i dendriti
Figura 27
NeuroImage- Pulsed infrared light alters neural activity in rat somatosensory cortex in vivo
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D’altra parte, questi studi affermano sempre più fortemente che rapidi segnali cal ci o propaganti si lungo i dendriti api cali indotti da INS, influenz ano il fl usso de i neurot rasm ettitori gl utammato e GAB A e, quindi, ris pettivament e l ’attivazione di neuroni ini bitori o l a soppressi one di quell i eccit atori , pi ù pres enti negli st rati superfi ci ali dell e cort ecce ris pett o a quelli eccit atori .
Per di più, questi ri s ultat i sono stat i riscontrati anche i n quegl i studi che han no stimol at o el ett ri cament e quei st es si ci rcuiti neurali inibitori , i cui effetti soppressivi aum ent avano all ’increm ent are