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ALMA MATER STUDIORUM – UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
CAMPUS DI CESENA
DIPARTIMENTO DI
INGEGNERIA DELL’ENERGIA ELETTRICA E DELL’INFORMAZIONE
“GUGLIELMO MARCONI”
CORSO DI LAUREA IN INGEGNERIA BIOMEDICA
TITOLO DELL’ELABORATO
APPROCCI BIOMEDICI OTTICI PER LA STIMOLAZIONE ED IL
MONITORAGGIO DELL'ATTIVITÀ CEREBRALE
Elaborato in
Fisiologia
Relatrice
Presentato da
Benfenati Valentina
Altieri Fabiano
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Sommario
A b stra ct ... 3 C A P IT OL O 1 ... 7 In tro d u z io n e ... 7 L a lu ce ... 7L’interazione della luce con la materia vivente ... 9
C A P IT OL O 2 ... 14
S co p o d el la R icerca : L a lu ce e lo stu d io d el cerve llo ... 14
C A P IT OL O 3 ... 15
I n eu ro n i ed i l l oro p r in cip i fu n z ion al i ... 15
O rg a n iz za z ion e d e l S is tema N ervoso ... 15
C A P IT OL O 4 ... 21
A p p ro cci e tecn o log ie foton ich e p er lo s tu d i o d el le ce l lu l e cer eb ra li .. 21
L a ser ... 21
F ib ra o tt ica ... 23
Mo leco le E s ogen e F o t osen s ibi l i ... 24
O p to g en et ica ... 38
R a d ia z io n e In fra ros sa ... 62
C o n clu si o n e ... 92
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Abstract
L’utilizzo della luce per lo studio del cervello ha principalmente riguardato lo svil uppo di t ecniche di im aging; m a, negl i ultimi anni , la fotonica ed i s uoi princi pi sono st at e utilizzat i per m ani pol are, stimolare e studiare l’attività di cellule cerebra li.
Lo scopo di ques to l avoro di t esi è quell o di pass are in rass egna in modo criti co e più recenti ri sult ati ott enuti nell a modulazi one ed attivazione di atti vi tà di cell ule neural i attraverso t ecni che che prevedono l’utili zzo dell a l uce .
Generalm ent e, la st imolazi one e d il m onitoraggi o consent ono l o studi o dell e att ivit à neurali che sono alla bas e dei controlli omeost ati ci fisiologi ci, della m emoria e di tutti i comport amenti anim ali , qual i aggres sivit à, sonno e fam e [1].
Si tratt a di t ecni che che i n un fut uro non molt o l ontano , pot enzialment e, pot rebbero sostitui re o, combi nandosi, migliorare quelle at tuali , che si bas ano preval ent em ente su fenom eni m agneti ci, com e l a ri sonanza magneti ca MR I, s u fenomeni acusti ci , come l’ecografia e su fenomeni elettrici, come la stimolazione transcranica a corrente diretta (tDCS) e l’elettroencefalogramma (EEG).
Inol tre, i l presente studi o rit iene che l a stimol azione otti ca poss a divent are una valida alt ernativa alla sti molazione el ettrica , anche perché il progress o di quest ’ul tim a, nonos tant e abbi a s us cit ato molto ottimism o nello svi luppo di int erfacce brain -computer (B C Is ), è ostacolat o da di ffi coltà che di ffi cilm ente poss ono essere s uperat e. Innanzit utto, il cervello è una struttura t ridim ensional e, perciò, pe r raggiungere gli st rati pi ù profondi, s ono necess ari inserim enti di oggetti est erni, gli elett rodi appunt o, pi uttosto densi ed è ben noto che questi pos sono i nnescare rispost e infiamm atori e.
Gli elet trodi , poi, non sono in grado di sti molare ne uroni speci fici in una regione popol at a da diversi tipi di neuroni ed al tre cell ule non nervose, com e gli ast rociti ; i nfi ne, m aggiore è l ’int ensit à dello
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stimolo elet tri co, m aggiori s ono i rischi di effetti indesiderati press o le cellul e circost anti agli elet trodi [2] [3], perché ques t’ultimi diffondono correnti i n tutt e le di rezi oni (Figura 1)Figura 1, riducendone
drasti cament e l a ris oluzione spazi ale e, qui ndi , l a quali tà dell a rispost a neural e.
Di cont ro, sfort unat am ent e, l a m aggi or part e degli approcci bas ati sull a neurostimol azi one ott i ca non h a, attualm ent e, l a capacit à di innescare o di i nibi re attivi tà el ett ri che a frequenze superiori a 400 Hz, m entre quell a el ett rica è i n grado di farlo anche olt re i 900 Hz , frequenze m assim e per cui i neuroni propagano APs consecutivam ent e.
Per es empio, l o studi o [4] ha confrontat o le rispost e neurali a front e di stim olazi oni otti che ed el ett ri che sui neuroni dell e vie udi tive di topi e ha ril evat o che l e prim e, m edi at e da una s eri e di mi crolas e r distribui ti in 3 aree del canale di R osent hal , evi denziano prestazioni migliori i n t ermini di rispost a neural e, ris petto a quell e del le stimol azioni elet tri che.
La stim olazi one ott ica , sfrutt ando i princ i pi dei fotoni, offre l a massi ma precisi one i n termini t emporali e spazi ali , in m aniera meno invasiva ri spetto a quell a elettri ca: i n t al modo, è possibil e focalizzare l a s timol azione su st rutt ure subcell ul ari , s ingole cellul e o su pi ù cellul e sim ultaneam e nt e, allo s copo di i ndagare quell e reti neurali che sono all a base di un determi nato comport am ento.
Il campo di ri cerca dell e neurosci enze , fin d agli albori del le pri me scopert e che hanno port ato all a comprens ione di numerosi funzionamenti cerebrali, ha compreso l e pot enzi alit à dell a stimol azione otti ca .
Figura 1
Journal of Neural Engineering - An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology
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Infat ti, gi à nel 1891, Arsonval [5] aveva os servat o che l a stimol azione otti ca dei neuroni pot eva avere l uogo, ment re Arvanit aki e Chalazonitis [5] negli anni ’60 dim ost rarono che l’eccitazione e l’inibizione sono fortemente dipendenti da parametri ottici dell a radi azione, com e l a l unghezza d’onda e l’int ensit à; tuttavi a, a quell’ epoca, per m otivi t ecnici, non si era ancora i n grado di m ani pol are q uest i parametri tant o cruci ali per l a neurostimol azione , che rim as ero poco approfonditi fino agli enormi progres si t ecnologi ci che permis ero l ’esplosione del successo di un nuovo approccio di s tudio.
L’avvento dei laser negli anni ’70, poi, ha contribuito enormemente al s uccess o dell e neuros ci enze, com e m ostrato dal la brevett azi one di tal e t ecni ca [6] e d ai risultat i d i num erosi st udi. Per es em pio , l o studi o [7] ha mos trat o com e l a stim olazi one ot tica m edi at a dal las er stesso, agi sca di ret tam ent e sul le cellule nervos e nel mollus co Aplysia .
Si è dovuto , i nfi ne, att endere gli i nizi degli anni ’90 [8] , con lo sviluppo dell a mi croel ett ronica e dell ’optoel ett roni ca e con l e maggiori conos cenze conquist at e nell a bi ologia, per ot tenere dispositivi e tecni che pi ù econom iche, vers atili e soprattut to reali z zabili .
Le tecniche di sti molazione o modul azione m ediant e luce pi ù importanti sono: [9] [10] [11]:l’opt ogeneti ca, l’uso di molecol e ingegnerizzat e fotoat tive [12] e l ’uso dell a radi azi one i nfraros sa . La scelt a dell a t ecnica di pende prim ariam ent e dall o s copo dell o studi o che si vuol e effettuare , perché ogni strum ento ha i suoi vantaggi e le sue li m itazioni [13].
L’optogenet ica consi ste nell ’indurre m odi fiche geneti che in specifi ci neuroni t ram ite microini ezi oni di vettori virali contenenti t ransgeni , i qual i, una vol t a i ntegrati nel genom a dei neuroni, andranno ad esprim ere prot eine foto s ensi bili .
La t ecni ca che util izza m ol ecole fot oat ti ve consist e principal ment e nell’iniettare neurotrasmettitori legati a molecole che li rendono attivi solo sottoesposizione lumi nosa.
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La radiazi one infraross a, che att raverso prot ocolli di s timol azione a differenti frequenze è in grado di i ndurre depol ari zzazioni o iperpolari zzazioni neuronali s enza l a necessit à di modifi care geneti cam ent e o chimicam ent e l e cellule, ma sfrutt ando il surris caldam ent o t ransient e che avvi ene a l ivello della m embrana cellul are [14].
Concludendo gli approcci des cri tti mostrano com e la l uce poss a essere un metodo fisico innovativo non soltanto per l’imaging del cervell o m a anche per l a sua m odulazi one con el evat a risol uzi one spazi al e e t emporal e, effi cacia e versat ilità e s icurezza. Tuttavi a, l’assorbimento della luce può causare effetti di fotodanneggiamento o modulazione incontrollata delle cellule. D’altra parte, gli strumento tecnol ogi ci che poss ano consent ire di ri las ci are l a l uce ai t ess ut i nervosi i n modo cont roll a to e guidato sono ancora limit ati.
In questo s enso, approcci ibridi di fotonica ed elett roni ca sono in fas e di st udio [15].
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CAPITOLO 1
Introduzione
La luce
In fisi ca l a luce è l a radiazi one el ett romagneti ca (EM ), ovvero l a radiazione dell’energia nel campo elettromagnetico ; essa esibisce propri et à carat terist iche si a dell e onde che dell e parti cell e, un concetto conosciuto com e duali smo onda -parti cell a.
Nel primo caso, l a natura on dul atori a del la luce consist e i n un’onda com post a di un campo el ettrico e, perpendicol arm ent e a quest ’ultim o , di un campo magneti co , ent ram bi os cill anti in fas e nel la di rezi one di propagazi one. Quest o comport am ent o è descrivibil e att raverso l e espressi oni m at emat iche dell e equazioni di Maxwell [16]. Se si considera l a l uce com e onda, p oss ono ess ere sp i egati divers i fenomeni tipici delle onde come l’interferenza e l’indice di rifrazione.
Nel s econdo caso , la nat ura corpuscol are della luce cons iste di pacchetti di energia, o quanti, denominat i anche come fotoni ; quest i, se post i nel vuoto, vi aggiano all a velocit à della luce stess a, velocit à che nessun’alt ra parti cel la dotata di mass a può superare. Tal e modello -particell a può , i nvece, spi egare quei fenom eni ti pi ci del le parti cel le, quali l ’as sorbim ento e lo spett ro otti co dell’emi ssi one da part e degl i atomi o molecol e (noto com e spett ros copia) .
Inol tre, s econdo il Model lo Standard, il fotone è l a parti cel la associ at a al l ’i nt erazione elettromagnetica, una delle quattro interazi oni fondam entali che compongono la natura.
L’interazione della radiazione EM con la materia dipende fortemente dall a s ua lunghezza d’onda, cui sono l egate l a frequenza1 e l’energi a2 [17], nonchè il profil o del l’im puls o otti co sia nel s enso spazi al e che temporal e: per esempio basse λ corrispondono ad alt e frequenze e, di conseguenza, alt e energi e , che, se eccessive, possono di struggere i
1 𝑣 =𝑐
𝜆 v= frequenza [Hz] c= velocità della luce nel vuoto = 299 792 458 m/s 2 𝐸 = ℎ𝑣 E= energia per fotone [J] h= costante di Planck= 6.626 070 15E10-34 J·s
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tessuti biologi ci. Infatti, quando l a luce i ncont ra un mezzo assorbente, ess a può perturbarlo in diversi modi : può rompere l egami molecol ari, comport arsi da catal izzatore per accelerare reazioni chimiche o creare onde d’urto/di pressione che attraversano i tessuti [16] [18] [19].
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L’interazione della luce con la materia vivente
I fenom eni in bas e ai quali l a propagazi one del fas cio di l uce vari a quando esso att raversa una porzi one d i m at eri a sono l a ri fl essi on e, l a rifrazione, l’assorbimento e lo scattering.In ambito biom edi cale, i prim i due fenom eni sono piuttost o trascurabili e diffi cil ment e cal col abili , in quanto i t ess uti umani, ad eccezione quelli del la cornea, sono opachi ; l a disom ogenei tà dei tessuti biol ogi ci , i nfatti, è l a m aggi ore li mitazi one che rende com pless a l a s celt a dei parametri .
Nel l’ambi to di uno s tudio che comport a l ’us o dei l as er, l a lunghezza d’onda della luce è il principale parametro di riferimento, perché è propri o quel lo che determina i più evi dent i effetti sui tessuti e da cui conseguono l’indice di rifrazione, il coefficiente d’estinzione, di assorbim ento e di scatt eri ng.
Riflessione e rifrazione
Se i l fas cio d ell a radiazione EM è ori entato di un certo angolo θi
(angol o di i ncidenza) rispett o all a norm al e del la superfi cie, il fasci o sarà ri fl ess o di un angolo θ’ (angolo di ri flessi one) , che è uguale a θ per l’impatto con la superficie stessa; tale fenomeno è definito
riflessione .
Si ha, invece, rifl essione t otal e se θi supera l’angol o li mite3,
situazi one che si veri fica quando l a luce pass a da un m ezzo con indi ce di rifrazi one m aggiore ad uno con i ndi ce di rifrazi one mi nore .
I vet tori di entrambi i fas ci e l a normale dell a superfi ci e gi acciono sullo stesso pi ano, chiam ato com e pi ano di incidenza. La rel azion e 𝜃𝑖 = 𝜃′ (Figura 2 ) è valida s olo s e
si as sum e che l a superfi ci e sia lisci a (ri fl essione specul are) , ovvero che l a di mensione della rugosit à si a tras curabile rispett o alla lunghezza d’onda; in caso
3 Il valore massimo dell’angolo di rifrazione è 90°; perciò, dalla legge di Snell si ha che l’angolo limite è
𝜃𝑙= sin−1(𝑛2⁄ ). Di conseguenza n𝑛1 2 < n1
Figura 2
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contrario, al lora preval e la rifl es sione diffus a, che è chi arament e caratt eristi ca di tutti i t essuti.
La rifr azione , i nvece, si otti ene quando l a velocit à dell a luce cambi a al vari are del m at erial e del m ezzo di propagazion e. La rel azione mat em atica che des crive l a ri frazione è conos ciuta come l a l egge di
Snell (Figura 2 )
sin 𝜃𝑖 sin 𝜃𝑟 =
𝑣1 𝑣2
Dove v1 e v2 corrispondono alle vel ocit à dell a l uce nei due mezzi ,
rispetti vament e prim a e dopo l a superfi ci e ri flettent e; θr è l’angolo
rifrazione (θ ’’ in Figura 2 )
Dall’indice di rifrazione di un certo materiale 𝑛 = 𝑐/𝑣 si ottiene: 𝑛1sin 𝜃𝑖 = 𝑛2 𝑠𝑖𝑛𝜃𝑟
La rifrazione e l a rifl es sione s ono fort em ent e l egat e tra loro att ravers o l e l eggi di Fr esnel .
Assorbimento
In linea di principio, l’ assorbimento ha luogo quando particelle cari che, com e gli elett roni, vengono espost e al campo el ett rico osci llant e delle onde EM la cui frequenza è in risonanza4 con quell a dell a parti cell a; qui ndi, essa acquisi sce una energi a quant izzata t al e da pas sare ad un li vello energeti co superi ore, im piegando ci rca 1 fs. Dopodiché, l’elettrone eccitato ritorna al livello energetico inferiore, ril as ciando un fotone, in ci rca 1 ps.
L’assorbanza del mezzo è definita come il rapporto tra l’intensità assorbit a ed i ntensit à inci dent e: se più fot oni vengono as s orbi ti, l’intensità del fascio elettromagnetico si attenua sempre più att ravers o il m ezzo. La probabilit à che il fotone venga assorbito è, poi, quantificata dal coefficiente di estinzione (ε – unità di misura: m2·mol- 1) di una molecol a. M aggiore sarà ε, m aggiore sarà l a probabilit à che un fotone venga assorbit o.
Chiarament e, l a capacit à di un m ezzo di assorbire l a radi azione EM dipende da una seri e di fattori: primari am ent e, dall a cost it uzi one
4 La risonanza si verifica quando il gap di energia elettronica (differenza del livello di energia tra lo stato
fondamentale e lo stato eccitato dell’elettrone) è uguale all’energia associata al fotone. In altre parole, quando si verifica che la frequenza dell’onda elettromagnetica uguaglia la frequenza naturale della particella colpita dal fotone stesso.
~ 11 ~ el ettroni ca dei s uoi atomi e d el le sue mol ecol e5 e, quindi, dall a l oro concent razione, dal la l unghezza d’onda della radiazione stessa, dall o spess ore dell o strat o assorbente e, infi ne, da param et ri interni com e l a t emperat ura.
Due s ono l e l eggi che mi surano l’effettivo assorbimento della luce da
part e dell a m at eria e, qui ndi , del tessut o esposto alla luce: l a legge
di Lambert e la legge di Beer .
𝐼(𝑧) = 𝐼0𝑒𝑥𝑝(−𝜇𝑎𝑧) 𝐼(𝑧) = 𝐼0𝑒𝑥𝑝(−𝑘′𝑐𝑧)
dove I(z) indica l’i nt ensi tà al la distanza z indi cant e l ’ass e otti co, µa
è il coefficiente di ass orbim ento del m ezzo, c è la concent razione degli agenti assorbenti e k’ è l a vari abil e che dipende da param e tri interni .
L’inverso del coefficiente di assorbimento corrisponde alla profondit à di penet razi one otti ca 𝛿𝑎 = 1 𝜇⁄ 𝑎; va detto che quest a rel azione non è affetto dallo scatt eri ng, il qual e i n realt à riduce maggiorment e l a profondit à.
Poiché i tessuti s on o com posti da num erose e svariate mol ecol e, com e l’acqua, le proteine ed i pigmenti , ciascuna di esse assorbe i fotoni in maniera differente a seconda della lunghezza d’onda dei fotoni stessi.
Per es empi o, l ’acqua presenta dei picchi di assorbim ento sparsi irregolarmente soprattutto tra le lunghezze d’onda dell’infrarosso. [20] (Figura 3).
Scattering
Nel caso in cui la frequenza dell’onda EM incidente non sia in risonanza con quella della particella, quest’ultima assorbe, comunque, l’energia del fotone, ma la riemette in una direzione e con un’intensità differente. Ciò fa sì che i fotoni incidenti rall entino
5 Ogni atomo o molecola ha un proprio spettro elettromagnetico, quindi proprie frequenze naturali,
corrispondenti ai picchi di assorbimento.
Figura 3
Photoacoustic imaging in the second near-infrared window: a review
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quando penetrano i n un m ezzo denso, dando origi ne al fenom eno dell a dispersione. In base alla conversione o meno di una parte dell’energia del fotone, si disti ngue tra scatt ering el as tico ed anaelasti co.
Nel pres ent e l avoro non verranno descritti mo delli di s cattering anaelasti co, t ra i quali scatt ering di Brill ouin e s catt er ing di Raman risul tano es sere i più appli cati .
Al cont rari o, si t ratt erà di s catteri ng el astico, in cui l e energie dei fotoni incidenti e deviati s ono l e stesse. La s celta t ra i vari modelli esist enti dello scatt eri ng el asti co dipende dall a dimensione dell a particella rispetto alla lunghezza d’onda.
Se la di mensione del la part icell a o dell a molecol a è suffi ci ent em ent e piccol a, prevale lo scat tering di Rayl ei gh ; l ’int ensit à del fas cio, simile a quella dell’assorbimento, è in funzione di z indicante l’asse di propagazione e del coeffici ente di scat tering µs:
𝐼(𝑧) = 𝐼0𝑒𝑥𝑝(−𝜇𝑠𝑧)
Attraverso opport uni cal coli di di fferenzi azi one e sostituzi one, la
legge di Rayleigh i mplica poi che l ’int ensi tà di s catt ering Is sia
fortemente dipendente da λ, infatti: 𝐼𝑠~ 1 𝜆4 .
Se, i nvece, la dim ensi one dell a parti cell a è ~λ, si ricorre allo
scat tering di Mi e .
In realt à, nessuno dei due modelli è i n grado di descrivere in m ani era precis a lo s catt eri ng nei t essuti biologi ci ; pert anto, si ri corre spesso all a funzi one di probabili tà p(θ) di un fot one di ess ere devi ato di un cert o angolo θ; anche di tal e funzione esist ono vari model li, ma il pi ù utili zzato è quell o conos ciut o com e Henyey– Gr eenst ein:
𝑝(𝜃) = 1 4𝜋
1 − 𝑔2
(1 + 𝑔2− 2𝑔 cos 𝜃)32
Dove g i ndi ca il coeffi ci ent e di anisot ropi a del mezzo in cui s i propaga l a luce.
Se 𝑔 = −1 , lo scattering è puramente diretto; se 𝑔 = 1, invece prevale lo scatt eri ng a rit ros o; i nfi ne , se 𝑔 = 0, allora avviene la scattering isotropi co.
Gli aut ori dello studi o [21] hanno, infatti, dimostrato che preval e lo scatt eri ng quasi diretto per tutt i i t essut i esami nat i, i n parti col are
~ 13 ~ quelli nervosi , con il cos eno m edi o dell 'angolo di s cat tering nell 'int ervallo 0,945 -0,985.
Considerando si a lo scatt eri ng che l’assorbimento, la profondità di penet razi one otti ca δ sarà, ovvi am ent e, inferi ore rispett o al caso i n cui si considera sol o l’assorbimento [22], infatti:
𝛿𝑒𝑓𝑓 = 1
√3𝜇𝑎(𝜇𝑠(1 − 𝑔) + 𝜇𝑎)
3
Inol tre, s e da un l ato i tessuti nervosi condividono propri et à ottiche simili in funzione della lunghezza d’onda (Figura 4), dall’altro ci sono differenze nett e tra l a m at eri a bi anca (WM ) e l a m at eri a grigia (GM) del cervello; per es em pio, i l coeffi ci ent e di esti nzione µt dell a
prim a è si gni fi cati vam ent e m aggi ore del suo com pl ement are anatomico per l’intero range spettrale investigato6 [21].
Lo st esso st udi o ha inves tigato anche come varia l o s catt ering in tessuti tum orali; poiché l a st ruttura di questi t ende ad ess ere macros copi cam ent e più disom ogene a, infatti, i valori dei coefficienti di s cat tering ott enuti sono maggi ori ri spet to ai tessut i s ani di m at eri a grigia.
6 λ = 800 nm: μ
wmt =36.96 mm-1 μgmt=7.68 mm-1
Figura 4
Photoacoustic imaging in the second near-infrared window: a review
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CAPITOLO 2
Scopo della Ricerca: La luce e lo
studio del cervello
Negli ultimi anni, l e t ecnol ogi e fotoni che hanno svolto un ruolo sempre più import ante nel s ost enere lo s tudio di organi smi viventi (ad es empio cell ule, piccoli anim ali e um ani ) in biol ogi a e m edici na. Le applicazioni biomedi che com e l a spett ros copia e l'i magi ng dei tessuti bi ologici sono oggi un campo di applicazione pri ncipal e per le t ecnologi e bas ate sul la l uce e i l termine bi ofotonica è com unement e us ato. Più speci fi cam ente, i metodi e le appli cazi oni bas ati sull'uso dell a luce nell e neurosci enze per co mprendere ulteriorm ent e i fenomeni cerebrali st anno cres cendo rapidam ente e un nuovo termi ne - neurophotoni cs - è st at o recentem ente coni ato per fare ri ferim ento a t utte l e discipli ne che l avorano atti vam ent e e in sinergia con i nterfacci a t ra otti ca e neur osci enza. Questi m etodi e applicazioni abbracciano una vari et à di soluzioni e st rum enti, com e metodi m icroscopi ci e nanos copi ci a super ris oluzione , optogeneti ca e alt ri m etodi otti ci per manipolare il comportam ento cell ul are, l'uso di mat eriali sint eti ci e report er ed attuatori ottici codifi cat i geneti cam ent e. Lo s copo di quest o l avoro di tesi è quell o di pass are in rass egna in m odo criti co e più recenti ris ult ati ott enuti nell a modul azione ed at ti vazione di atti vit à di cellul e neurali at traverso tecni che che prevedono l ’util izzo dell a l uce.
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CAPITOLO 3
I neuroni ed il loro principi
funzionali
Organizzazione del Sistema Nervoso
Il Sist em a Nervoso si divide in sist em a nervoso cent rale (C NS), in sistema nervos o periferi co (P NS) ed in sist em a nervoso enteri co (ENS).
Il primo, che processa inform azioni proveni enti da al tre part i del corpo e l e ri nvi a ad ess e, incl ude cervel l o e corda spi nal e, entrambi prot ett i ris pettivam ente dal t es chi o e dall a colonna vert ebral e. Il cervell o è organi zzato com e una rete compless a ed i nt ri cat a, in cui sono pres ent i anche vas col at ure ed alt re cellul e non nervose, com e ast rociti, cel lul e gl iali e cell ule endoteliali [36].
Invece, P NS incl ude neuroni afferenti/s ensori ali e neuroni efferenti. Quelli afferenti, organizzati perlopiù in “fasci ”, ricevono inform azioni dai recettori s ensori ali post i nei tes suti peri feri ci e negl i organi e l e t rasm ettono al C NS; i neuroni efferenti, invece, ri cevono com andi dal C NS e li rinvi ano a speci fi ci bers agli , per la m aggior part e cos tituit i da m uscoli o gh i andol e. S ono neuroni efferenti anche quelli che det erminano il sist em a s impati co e parasim patico.
ENS, infine, comprende i neuroni appartenenti all’apparato digerent e, in grado di regol are la digest ione comuni cando con l a flora intestinal e.
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I neuroni
Sebbene ad oggi num eros e evidenze indichino che non si ano l e uni che cellul e che controll ano l a capacit à di ricevere, di el aborare e di inviare segnali, i neuroni sono ad oggi ancora considerati l’unità funzionale del Sis tema Nervoso [23]; essi sono capaci di ri cevere una serie di s egnali el ett rici, noti come pot enzi ali d’azi one (APs ), process arli e t rasm et terli a neuroni adi acenti o ad al tre cellul e non nervose.
A livell o morfologi co o funzional e, esiste una grande variet à di neuroni, m a t utti condividono t re di stint i regioni: i l corpo cell ulare, o soma, i dendriti ed un as sone.
Il soma contiene il nucleo, i vari organuli necessari per l’attività cellul are ed un a m pio cit os chel etro, il qual e s i di ram a verso i dendri ti e gli ass oni, fungendo da impal cat ura cellul are e da m edi at ore di trasport o di ves ci col e contenenti proteine necess ari e.
I dendriti hanno il ruolo primari o di ri cevere l e i nformazioni i n arrivo da altre cellul e nervose e di t rasm et terle verso i l cent ro di integrazione, definit o zona t rigger .
Al cont rario del s om a e degl i as soni , i dendri ti determi nano, i n l arga misura, la vari abilit à si a funzionale che morfol ogi ca dei neuroni: infatti , i neuroni affer enti del PNS poss ono avere un solo dendrit e, ment re quelli del C NS pos sono avere compl ess e rami fi cazi oni di dendri ti.
Inoltre, sulla superficie di quest’ultimi possono essere presenti anche spine dendriti che, unità praticam ent e indipendenti , perché, oltre a ricevere il contatt o s inaptico di alt ri neuroni, al l oro int erno s pes so contengono i pol iribosomi , enzimi in grado di sinteti zzare protei ne propri e.
Circa gl i as soni , l a m aggioranza dell e cell ule nervose ne ha uno s olo, che si est ende da una zona speci al i zzata del soma con lunghezze che possono vari are da pochi mm fino a 1 m; APs avanzano lungo questa regione con una velocit à che raggi unge i 100 m/s se adeguatament e rivestit e da guai ne m ieliniche.
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Va specificato che, nonostante l’assone sia fondamentalmen te uno per ogni cell ula nervosa, dalla sua superfi ci e possono emergere ram ifi cazioni coll at eral i.
è chi amata sinapsi la regione i n cui il terminal e assonico di un neurone presinaptico incont ra una cellul a bers aglio, o un dendrit e i n caso di neurone post sin apti co.
I neuroni , come t utt e l e alt re cell ule viventi, hanno un pot enzial e di membrana a riposo, che in m edi a è di -70 mV. Esso è condi zionato dall’ineguale distribuzione degli ioni ai capi della membrana e dalla different e perm eabil ità dell a m em brana a t ali i oni: se quest e due caratt eristi che vengono alt erat e, si m odi fica, cons eguent em ente, il pot enziale di mem brana.
Ad esempio, l’aggiunta di ioni Na+ nel citopl asm a depolari zza l a
membrana cellul are, inducendo l a cellula ad ess ere più positiva; ment re, con una perdita di ioni K+ o con un aum ento di ioni Cl-, la membrana si iperpolari zza, inducendo la cell ul a ad ess ere più negati va.
Se gli ioni pri ncipali che det erminano la vari azi one di pot enzi al e di membrana sono gli i oni K+, pi ù concentrati nel cit opl asm a, e gli i oni
Na+, Cl- e C a2 +, più concentrati nell’ambiente esterno, i mediatori degli s post am enti di tali ioni sono i canal i ioni ci a cancello.
In genere esist ono vari tipi di canali ionici a cancello, m a 3 di quest i sono quelli m aggi orment e present i nel l e m embrane di neuroni : i canali ioni ci regol ati meccani cam ent e, che si t rovano preval ent em ent e nei neuroni s ensoriali e che si at tivano in funzi one di uno stim olo m eccani co, com e la pressi one; i canal i ionici regolati chimi cam ent e, pres enti pressochè in t utt e le cel lul e nervos e, e che si aprono, per esem pi o, quando li gandi com e i neurot rasm ettit ori attivano t ali canal i; infi ne, i canali ioni ci vol taggio -di pendenti, che si aprono i n presenza di cambi am enti l ocali zzati di potenziali di membrana.
Tali pot enzi ali di m embrana sono classi ficati in pot enzi ali graduati ed in potenziali d’azione.
~ 18 ~
I potenziali graduati
I pot enzi ali graduati , general ment e ori ginati nei dendri ti e nel soma, sono s egnali di iperpol arizzazione o di depol arizzazione, con un’ampiezza proporzionale all’intensità dello stimolo. L’intensità di tali segnali si riduce all’aumentare della distanza dal punto di origine per di ssipazione di corrent e e per resist enza del cit opl asm a.
Successivam ent e, questi s egnali raggiungono l a zona t rigger, nell a quale s ono pres enti ad alte concentrazioni canal i Na+ vol taggio -dipendenti sulla m embrana, che, com plessivam ent e, st abilis cono il livel lo sogli a i n termini tem porali7 o spazial i8, affinchè si poss a innescare un AP .
Va not ato che ques to ti p o di organizzazione varia da neurone a neurone ed è ciò che contraddisti ngue la bas e del process am ent o dell e inform azioni nel sist em a nervoso.
I potenziali graduati depol arizzanti sono considerati eccit atori se le loro i nt ensit à sono maggiori o ugual i al l ivel lo sogli a9; in t al caso, i canali Na+ in prossi mità dell a zona t rigger si aprono cons entendo infl ussi di Na+, con la cons eguent e ult eri ore depol ari zzazi one di membrana dando ori gine ad un AP. Al contrario, i pot enzi ali graduati iperpolari zzanti s ono co nsiderati inibitori , perchè riducono la s omma dell e i nt ensit à dei potenzi ali graduati depol ari zzanti all ont anandol i dal livello sogli a.
I potenziali d’azione
Una volt a che un AP vi ene originat o nella zona t rigger, grazi e all’influsso di Na+, l a sua propagazione non dim inui sce di int ensi tà,
al contrario di quant o accade ai pot enzi al i graduati.
Infat ti, quando il pot enzi ale di m embrana da -60/-55 mV raggi unge i +30 mV per via dell’influsso di Na+, contem poraneam ent e i canali
Na+ si chiudono ed i canal i K+ s i aprono; attraverso questi, i oni K+ es cono dall a cel lul a, ripolari zzando l a m embrana verso il pot enzi ale di ripos o.
7 Numero minimo di segnali in un intervallo di tempo 8 Numero minimo di segnali simultanei nella zona trigger 9 Per i neuroni di mammiferi il livello soglia = -55 mV [23]
~ 19 ~ Durante il suddetto
intervall o, definit o com e periodo refrat tario ass oluto, non si poss ono i nnescare
ulteriori AP s
indipendent ement e
dall’intensità per circa 1 -2
ms; ciò fornis ce ai cancell i dei canali Na+ tem po s uffi ci ente per ritornare allo st at o di ripo so. Ne cons egue che APs non possono sovrapporsi e propagarsi i n senso i nverso.
Al periodo refratt ari o as soluto, segue il periodo refrat tario rel ativo, durant e il quale non tutti i cancelli dei canali Na+ sono tornati all a posi zione ini zi al e, m ent re quel li dei canal i K+ sono ancora aperti. In questo l ass o tem poral e, è pos sibil e innes care un AP a patt o che il pot enziale graduato depol ari zzant e che lo provoca si a pi ù i nt enso del norm al e, i n quanto l a membrana può essere iperpol arizzat a fi no a -90 mV.
La conduzione di un AP lungo l ’assone è dovut a ai fl ussi l ocali di cari che dell a regione atti va, che provocano l a depol ari zzazi one di nuove sezi oni di m embrana ( Figura 5).
Infat ti, l e cari che positive, i nt rodott e nel citoplasma att raverso l a depol ari zzazi one di una s ezione di assone, si di ffondono in t utte l e direzioni , poi ché at tratte dall a carica negati va del pot enzial e di membrana a riposo.
Quell e che si di ffondono verso il t erminal e assoni co, inducono all’apertura di canali Na+ dell e sezioni successive dell a m em brana,
generando nuovi AP; ment re, quelle che si diffondono a ri troso, verso la zona t rigger, non innescano al cuna depol ari zzazi one, perché i canali Na+ precedenti si trovano ancora all o st ato refrat tario ass oluto e, qui ndi, inatti vi.
Va not ato che per l a propagazi one di pot enzi ali graduat i e di un AP, sono sufficienti concent razi oni di ioni K+ e Na+ rel ativam ent e trascurabili rispetto a quell e rela ti ve all ’interno ed al l’est erno dell a cellul a.
Fisiologia umana. Un approccio integrato
~ 20 ~
Nel mom ent o in cui un AP arriva al t ermi nal e ass oni co, esso i nnesca l’apertura di canali Ca2 + vol taggio -di pendenti; att ravers o t ali canali,
per gradi ent e chimi co, nel citoplasma ent rano i oni C a2 +, provocando l’esocitosi di ves cicol e cont enenti una quantit à cost ante di neurot rasm ettit ori o di neurom odul at ori , che vengono ril as ci at i nello spazio si napti co.
In base all’intensità dello stimolo iniziale, si determina la frequenza del treno di APs consecut ivi e, cons eguent em ent e, la quanti tà di neurot rasm ettit ori ril as ci ati.
Successivam ent e, t ali mol ecol e andranno a l egarsi con specifi ci recettori di membrana dell a cell ul a postsi naptica det erminando così speci fi che rispost e.
È import ant e not are che non si t ratt a di un a comuni cazione unil ateral e; piuttost o di una comunicazione bi lat erale, perchè l e cellul e postsi napti che, a loro volt a, poss ono inviare neurom odulat ori ai neuroni presi napt ici. Questa propri et à dei neuroni di regol are l’attività a livello delle sinapsi è d efinita plasticità sinaptica.
Se i neurotrasm etti tori si legano a recettori accoppi ati a protei ne G, si att ua un pot enzi al e sinapt ico lento; m ent re, s e si l egano a canal i ionici, provocandone l’apertura, si attua un potenziale sinaptico vel oce, di tipo ec cit atori o (EPSP) o di ti po ini bitorio (IPSP).
~ 21 ~
CAPITOLO 4
Approcci e tecnologie fotoniche per
lo studio delle cellule cerebrali
Laser
L’introduzione dei laser nei laboratori di ricerca [8] ha permesso di indagare i n m ani era precis a e di porsi nuove domande negli st udi. Esist ono due sist emi las er [24] : quell o ad onde continue (C W), che consist e in l as er a gas e, in casi rari , all o stato solido, e quello ad impulsi , che viene ampiam ente utili zzat o nei s ettori che coinvolgono tessuti biologi ci, i n parti col are nervosi; si tratt a prim ari am ente di las er allo st ato solido e l as er ad eccim eri .
Recentemente, in ambito m edi co, sono state ott enut e ul teriori migliori e nel le t e cnologi e dei diodi l aser, ora molto economi ci ed i n grado di emett ere radiazioni si a C W che ad im pulsi , e dei l aser ad el ettroni liberi , at tualm ente estrem ament e precisi i n quanto forniscono impulsi di durate che raggiungono l’ordine del fem tos econdo.
Combinando ult rafas t laser a st ato sol ido, lenti otti ci ad alt a apertura num eri ca10 (NA) ed altri componenti , si poss ono, i nolt re, ott enere tecnol ogi e com e il l as er Two -Phot on Excit ation Li ght (TP E - las er 2P), versione success iva del laser One -Photon Excit ation Light (OP E) [25]. Quest a s trumentazione, pur ess endo not evolm ent e dis pendios a e fortemente dipendente dalla lunghezza d’onda utilizzata, è stata proget tat a i ni zial mente com e mi cros copi o, per vi a dell a eccezional e capacit à di forn ire un imagi ng di un volum e a pin -point di dim ensioni simili a quell e di l arghe spi ne dendriti che, i n maniera altament e locali zzat a, s ia i n vi vo che in vitro . Essa cons ent e, inolt re, anche una maggiore penetrazione dei tessuti ed una ridotta fototossi cit à, dat a l a sua natura di eccitazione non li neare, per cui , due fotoni , e non uno come nel caso di OPE, di lunghezze d’onda doppie rispetto alla
10 𝑁𝐴 = 𝑛 sin 𝜃; n è l’indice di rifrazione; θ è la divergenza del fascio. Se il profilo di un laser è di tipo
gaussiano, Na può essere scritta in questo altro modo: 𝑁𝐴 ≅ 2𝜆0
𝑛𝜋𝐷; λ0 è la lunghezza d'onda nel vuoto della
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versione OPE ( Figura 6) vengono assorbiti s imult aneam ente vi a stadio virt uale.
Per questa ragione, t ale t ecnol ogi a vi ene, successi vament e, largament e appli cat a in photo -uncaging di mol ecol e, i n parti colare i neurot r asm ettit ori photocaged, ut ilizzati nel s ett ore neuroscientifi co [26] [27].
Difatti , in quest o m odo si attivano quel le mol ecol e solo nel pi ano focale, anzi ché li berare in prossim ità delle spine dendriti che ed in massa i neurotrasmettitori lungo un’intera colonna, per via dell’eccitazione lineare.
In concl usione, i param et ri fondament al i per l a progettazi one dei las er che verranno appli cat i poi sui t essuti bi ologi ci sono: l a durat a di esposizione, che det ermina gli effetti t ermi ci, generalment e secondo “la regola del 1µs”, per cui con durate inferiori gli effetti termici poss ono ess ere cons iderati tras curabili se con frequenze di impulsi moderate; la lunghezza d’onda, che determina la profondità di penet razi one, dipe ndent e da scat tering ed assorbim ento; la densi tà di energia ed, infine, l’intensità effettiva, nota come energia radiante.
Figura 6
Frontiers in Synaptic Neuroscience - Two-Photon Uncaging of Glutamate
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Fibra ottica
Sviluppat e ed i nnovate dai premi Nobel i n Fi si ca 2009 Charl es Kao, Will ard Boyl e, e George Smit h, l e fibre ot tiche at tua lm ent e s ono com unement e usate per num erose appli cazioni e rappres ent ano una tipologia di guida d’onda11 per l e radi azioni EM.
Si compongono di un nucl eo cil indri co cent ral e, il core, in genere fat to di s ilica ult ra -pura, circondato da un mantello, il cl adding ; all’esterno della fibra è presente una guaina protettiva, il jacket, che isola la parte interna, proteggendola dall’ambiente esterno, da stress fisi ci e dalla corrosi one. S e l a l uce entra nel nucl eo con una cert a angol azi one, ess a si propagherà lungo l a fi bra trami te una serie di riflessioni tot ali al la superfi ci e di separazione fra i due m at eri ali del nucleo e del mant ell o.
Infatti, l’indice di rifrazione del core è leggermente maggiore rispetto a quello del claddi ng.
Grazie alla economi cità e all a ve rs atilit à dell e fibre otti che, ne esist e una grande variet à, s ebbene con di fferenti parametri come il di am etro del nucl eo, da cui è possi bil e ricavare NA12, gli i ndi ci di rifrazione, le caratt eristi che del mat eri al e e il drogaggio apport ato nei material i stessi del core e del cl addi ng.
È importante precisare, in particolare nell’ambito medico, che non è possi bil e s ervi rsi di fibre ottiche con diamet ri i nferiori a 4 μm per limitazi oni fisi che; la propagazione di onde EM cess a, infatti, di essere efficace [14].
Tutt avi a, ancora i n ambito m edico, è propri o grazie al la ridotta dimensione dell e fi bre otti che ed all e propri et à che l e det erminano che si pres ent a il vantaggio più im port ante rispett o ai convenzionali fili che t rasport ano s egnali el ettrici [9]; ovvero, l a possibilit à che le fibre otti che offrono di proi ett are l a radi azione luminosa su una porzione di t ess uto m olto pi ccola in m ani era focal e, al contrari o dell a diffusi one dell a corrent e che si espande i n tutt e le di rezi oni.
11 La guida d’onda è un tipo di mezzo di trasmissione, il quale consente la propagazione guidata di onde
elettromagnetiche all’interno di una data struttura.
12 𝑁𝐴 = √(𝑛 1 2− 𝑛
2 2); n
1 è l’indice di rifrazione del core; n2 è l’indice di rifrazione del cladding. Una elevata
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Molecole Esogene Fotosensibili
Una t ecni ca efficiente per alt erare da remoto i comport am enti dei neuroni, ut ili zzando l a luce13, consi ste nel l’us o di mol ecol e che in
qualche modo sono s ensi bili all a luce st essa e rispondono al t erando le proprie funzioni e strut ture .
Ess e si suddividono i n due categorie: m ol ecol e i ncapsul at e i n gabbi e fotolabili [9] [13] 14 e piccol e mol ecol e fot o -bi st abili [13] [28]. I caged molecules s ono una combinazione di differenti gruppi di molecol e: elem ento chiave è il gruppo prot ettivo fotolabil e che, confinat o ent ro una fines tra spazial e e t emporal e ed esposto alla luce, libera il gruppo bioattivo cont enuto i n ess o. Il gruppo bi oatti vo consist e in biom olecole che , l egandosi a recet tori m et abotropici15, innescano depol arizzazioni inducendo AP s in caso di neurot rasm ettit ori glutam mato 16, o i perpolari zzazioni in cas o di neurot rasm ettit ori GABA.
In s ett ori diversi dall e neuros ci enze, i l gruppo bioatti vo i ncl ude anche alt re biom ol ecole , che influenzano l e atti vit à nervos e e non , com e buffers di cal cio o di sodio , nucl eotidi com e ATP, peptidi e perfi no mRNA e DNA17 [29].
Per quanto riguarda il gruppo prot etti vo, l e gabbi e devono es sere chimi cam ent e e bi ol ogi cam ente inerti, m a diffi cilm ent e si è i n grado di ott enere gabbi e i deali e, per questa ragi one, è in att o una fort e ricerca che si dedi ca allo st udi o e alla progett azio ne di nuove gabbie , data l’enorme variabilità chimica . Va sottolineato che, in genere, la proget tazi one dell e gabbie dipende dall a nat ura dei loro cont enut i. Le mol ecol e bi -st abi li, invece, fungono da foto -s wit ch e n e es istono moltepli ci configurazioni , ciascun a dell e quali si is omeri zza i n risposta a determinate lunghezze d’onda della luce. La maggior parte di quest e molecol e fotois omeri zzabili o fotoattivabi li , però, ri chi ed e
13 Illuminazione 2P e UV
14 Per evitare ridondanze, in questo lavoro, la frase “molecole liberate/incapsulate in gabbie” verrà mantenuta
nella sua traduzione originale “uncaged/caged molecules”
15 Il recettore metabotropico è primariamente una proteina G che, una volta legatosi il ligando, innesca una
cascata di risposte intracellulari [23]
16 Il glutammato è un anione di acido glutammico, da non confondere con il glutammato monosodico 17 Il presente lavoro tratterà prevalentemente dei neurotrasmettitori glutammato e GABA
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una m anipol azione g eneti ca affi nchè vengano es press e et erologam ent e s ui recettori ionot ropi ci18 dei siti di affinità [28] [30] , dove l e m ol ecole in questione possono l egarsi .
A di fferenza dell e prot ei ne utili zzat e nell ’optogeneti ca, la cui rispost a nervos a è provocata dalla foto -at tivazione principalm ent e di ChRs o HR s, l a ri sposta nervosa è m ediat a dalla foto -is omeri zzazione dell a m ol ecol a che funge da bott one a canali ionici com e canali K+. Si ricorre a questo approccio per indurre c orrenti depol ari zzanti o iperpolari zzanti s u speci fi ci ti pi di cel lule o s ubregioni cellul ari mirate. C omparat o al l’approccio non genetico del ril as ci o di li gandi, la stim olazi one otti ca avvi ene in m ani era mol to pi ù accurat a e speci fi ca .
L’idea di approcciarsi all’utilizzo della luce per liberare molecole bioattive, a parti re da precursori inerti , risal e agli anni ’80 , quando si s coprì che gli esteri 2 -nitrobenzyl (NB ) l egati ad ATP o a nucleotidi , veni vano sci ssi sott oesposizione di luce ult raviolet ta (<340 nm ) [31].
Tutt avi a, ess endo l e molecol e libere di NBs reatti ve bi ologicament e, fu necess ario svil uppare approcci migl iori .
Lo svi luppo di fot o -s wit ch e di gabbie è cres ciut o, infatti, sem pre più negli ultim i anni, per m erit o dei s ost anzi ali progress i dei m at eri ali , dell a chi mica e della genetica, che hanno consentito un am pli ament o dell e potenzi ali tà di drug -delivery ai neuroni, rendendolo u n avanzato ed i mportante st rum ento per i nvesti gazioni neurosci entifiche [26] [28] [32], oncologiche e per l a ri generazi one dell a vist a [33].
In parti colare, nell e neurosci enze tal e m etodo ha contribuit o , t ram ite luce, all a com prensi one di ci rcuiti neurali a m aggiori ri sol uzioni e dell a connettività funzi onale dei neuroni , come il process am ent o di informazioni nervose e l’immagazzinamento e l’integrazione degli input ecci tat ori sinapti ci [26] [28] in numerose aree cerebrali , princi pal mente l e cort ecce visi ve e sensor i ali [9]. Nonost ant e ciò, a d oggi si ril evano li m itazioni a caus a di effetti indesiderat i, quali il ril ascio di bi omolecol e in m ani era non
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total mente precis a e controllata e la toss icità dei sott oprodotti. È bene precis are, inoltre, che l’uncaging di neurot rasm ettit ori è al tam ent e effi cace sol o per guidare l e singol e atti vazioni s inapti che i n spine dendri tiche, rendendo questo approccio inutili zzabi le per lo studio di rispost e nervose in s iti non si napti ci [26] .
I composti “ingabbiati”
Perché l’efficacia di un gruppo protettivo per neurotrasmettitori [29] [34] si a garantit a, è necessari o che la ci neti ca della reazi one fotoliti ca s i real izzi in un range di tem po del milli secondo , in modo che i neurot rasm ettit ori inneschi no o i nibiscano AP s.
I s ottoprodotti d el gruppo prot etti vo che si ott engono da quest a reazione fotoliti ca , devono rim anere il pi ù poss ibil e bio inert i e, successi vamente , ess ere es pulsi dal sit o e dall ’organismo att raverso la ci rcol azi one s anguigna.
Num erosi st udi [13] [26] [29] [34] riport ano che l’approccio m igliore per i nnes care la reazione fotoliti ca del compl ess o gabbi a -biomol ecol a, richiede l’utili zzo di u n mi cros copio l as er 2P ; quest’ultimo agisce in una sezione trasversale più ristretta, nitida e profonda ri spetto al las er 1P [31], che, ol tretutt o, richi ede l’ut ilizzo di luce con lunghezze d’onda dell’UV , soggetta maggiormente a scatt eri ng e ad assorbimento , con possibi li ingenti danni ai t essuti. Per quest e ragi oni, si è cercato di progett are gabbi e fotoattivabili con las er 2P , con lunghezze d’onda che arriv ino fino a quelle dell’infrarosso, in modo da ridurre il più possibile lo scattering e rendere, quindi, poss ibile l ’accesso all e a ree pi ù remot e del cervello. Nel le Figura 7.B e Figura 7.C dell o studio [26] vi ene most rat a l a precisione del l as er 2P (puntino rosso) ; infatti , il l as er è in grado di fotoatt ivare s olo l e gabbi e espost e in prossimit à di una spin a dendri tica proveni ente da una cul tura di neuroni m uri ni , ril as ci ando neurot rasm ettit ori di glut amm ato che andranno successi vam ent e a legarsi ai recett ori ionotropi ci AMP A.
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I neurot rasmettitori di glut amm ato sono t ra i princi pal i neurot rasm ettit ori nei t es suti nervosi di numerosi m ammi feri 19, motivo per cui i glutamm ato -caged sono largam ent e usati nei vari studi di neuros cienze.
Al contrario del gl utamm at o, il neurot rasmettitor e GAB A è poco adeguat o all ’approccio dell e gabbi e, le quali vengono poco ingegnerizzat e, perché vari studi [34] ri port ano che i GAB A -caged hanno propri et à fot ochimiche e farmacologi che s favorevol i: per es empi o, l a maggior part e dei GABA -caged pres ent a un com portam ento ant agonis ta prim a che avvenga la fot olisi tra l a gabbi a e il neurot ras mettit ore i n questione.
In realt à, il pres ente studio è rivolto ad un set tore di ricerca ancora in fas e di svil uppo , t ant ’è che i glut amm ato -caged ed i GAB A -caged in grado di soddis fa re tutti i requisiti neces sari per il fot orilas cio ottim ale negli studi dell e neuros ci enze sono a tutt ’oggi ancora pochi. Di s eguito, ne vengono present ati al cuni.
2-nitrosobenzaldehyde (NB) - Ach
Le pri me gabbi e util izzat e, alla fi ne degl i anni ’80, erano a bas e di NB [31]; utili zzat e per studiare, con i neurot rasm ettit ori Ach, l a cinetica e l’attivazione dei recettori nicotinici .
Non esibivano, però, una buona sensibilit à t ramit e l as er 2P e si era cost retti ad us are laser 1P, per fornire suffi ci ent e energi a utile a fotoatt ivare le gabbi e NB . Ciò provocava da nni ai t es sut i e, i nolt re,
19 Nei tessuti nervosi umani, il glutammato costituisce oltre il 50% dei neurotrasmettitori [23]
Figura 7
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la reazi one fotoliti ca l as ci ava sottoprodotti piutt osto reattivi , che pot evano comprom et tere lo studi o dell e funzioni sinaptiche.
α-carboxy-2-nitrobenzyl (CNB) –Glutammato&GABA
Il C NB è tra le prim e gabbi e meglio reali zzate . Una s ingola molecol a di gl ut amm ato è ingabbi at a t ra due gruppi prot ettivi di CNB, i quali, con l’assorbimento di due fotoni emessi da una sorgente laser 2P, si separano rapid am ente dal gl utammat o che, di s eguito, attiverà recettori ionot ropi ci con un andam ent o t emporal e normale (0.5 m s) [29] [34] .Poco st abile, i nvece, risul ta il fotoril ascio del GABA, perchè il GAB A-caged pres ent a com portamenti ant agonisti [29].
4-methoxy-7-nitroindolinyl (MNI) - Glutammato
I gruppi protet tivi M NI evidenzi ano la pi ù al ta sensibilit à con il laser 2P: i nfatti , poss ono ess ere fotoliti zzat i i n un volume inferiore a 1 μm3, risoluzione spaziale minima che consente l’attivazione dei
recettori per il glut ammato a livell o di si ngol a s pina dendriti ca. Inol tre, il t asso di li berazi one spont anea di glutamm at o in as s enza di las er 2P è mi nino, se non null o, e i sottoprodotti dell a reazione fotoliti ca s ono i nerti e non alt erano l e funzi oni neuronali [13] [34]. Nella situazione in cui si usi laser 2P con lunghezze d’onda dell’infrarosso (730 nm), è richiest a una concentrazione maggiore di MNI-glut amm ato , cosa che può int erferi re con lo st udio del le reti neurali basat e sull e cineti che dei recettori ionot ropi ci.
RuBi-GABA
Bas ato sull ’el emento atomico Rutenio, questo compl es so i norgani co offre l a possibi lit à di utilizzare i n mani era sicura e m igliore il GAB A, per l’assenza di comportamento antagonista prima della fotolisi. Inol tre, l e R uBi-GABA possono essere attivat e con una rapida cineti ca e con luce visi bil e, il che cons ent e l ’ut ili zzo di tal e com plesso a m aggior e profondit à nei tessuti nervosi rispetto a d altre GAB A-caged [35] .
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Hydrogel fotosensibile
L’utilizzo dell’idrogel fotosensibile è un approccio che sta recent em ent e atti rando molta attenzione , soprat tutto da part e di quei sett ori che si occupano di ingegneri a tiss utal e e di drug -deli very. Il suo s uccess o è dovut o all a el evat a flessibilità e bioc om pat ibili tà, ch e caratt erizza, com unque, tutt i gli i drogel : i nfatt i, l ’idrogel può cambi are form a , avere un payload mol to variabil e e può ess ere degradato da parte dell ’organi smo s enza che si atti v ino ri spost e infi amm atori e. C ombina ndo quest e propri et à con quell e dell a l uce, s i ottiene un sis tem a di drug -delivery di molecol e bi oattive molto effi ci ent e [32].
Le neurosci enze prevedono 2 approcci pri nci pali : idrogel fotot erm ici ed idrogel phot o-cl eavabl e.
Il prim o consist e nel l’int egrazione di nanoparti cell e nell ’idrogel , in grado di ass orbi re la l uce e convert irl a in calore ; ciò induce cambiamenti della struttura dell’idrogel circostant e e comporta il ril as cio di neurotras mettit ori cari cati nel l’idrogel st ess o [32] [36]. Il s econd o, i nvece, consist e in i drogel che, i n ri sposta all a luce, subis cono vari azioni st rutturali o degradazioni , con conseguent e dispersione in sito del contenut o.
Rimangono probl emi quali l a fabbricazione e l’int roduzione di questo tipo di gruppo prot ettivo nel sist em a bi ologi co, in part icolare nel cervell o, perché l o studi o [36] ha ri s contrato che gli hy drogel neurot rasm it ter -caged oltrett apas sano con di ffi coltà l a barri era em atoencefali ca.
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I photoswitches
I phot os wit ches , al contrario dell e mol ecole caged, vengono uti lizzati nel caso sia richiesta un’alta specificità tra ligando e recettore a livel lo di singol a sinapsi ed un controllo spazio -t emporal e maggiore circa l a di ffusione e la s eparazi one del li gando [28] .
Le m olecole che fungono da photos wit ch, ovvero “bottoni ” s ensibili all a l uce, in genere s ono di nat ura sint eti ca e s ono capaci di cambiare la propri a st ruttura chimica in m ani era reversibile ass orbendo la luce ; tal e fenomeno , not o com e fotoisom erizzazione , può i nnes ca re depol ari zzazi oni o i perpol ari zzazioni in una scal a t emporale del picosecondo, tem pi i nferi ori di diversi ordini di grandezza ris pett o a quelli dei norm ali processi bi ologi ci .
Altre propri età uti li i n ambi enti fi siol ogi ci, includono l a sel ett ività a det erminati s pettri di ass orbim ento dell a l uce , l a solubilit à in acqua, la st abili tà i n caso di event i chimi ci quali i drolisi, ossi dazione e riduzione, e, ovviamente, l’assenza di tossicità [33]. hv1
Esist ono num erosi e differenti photoswit ches , m a la maggi or part e di essi ha l o st ess o gruppo chimi co di part enza : si t rat ta di azobenzene20, una mol ecol a che, s copert a nel l’ ‘800 ed impi egat a nell ’indust ri a dell e tint ure, vi ene oggi m olto util izzat a per appli cazioni biol ogi che , in parti colare nel s ett ore dell e neuros ci enze [28] [37], grazi e al le sue eccell enti propri et à e biocom pat ibilit à .
L’azobenzene, allo stato di riposo, è un isomero con una conformazione trans ed è molto stabile rispetto all’isomero di alta energi a che ha una conformazione ci s. Infatti, in ass enza di illuminazione e d al lo stato di
equilibrio, l’isomero trans-azobenzene si pres ent a nel 99.99% dei casi con una conform azione pl anare , come viene mostrat o nella Figura 8. A e mom ento dipol are ~0 D21. Se
20 Ci sono altri gruppi chimici rilevanti come spiropyrans, diarylethenes, fulgides, naphthopyrans, e stilbenes;
tuttavia, il seguente lavoro si incentrerà prevalentemente sull’azobenzene.
21 Debye: Coulomb·metro
Figura 8
Chemical Society Review -Azobenzene photoswitches for biomolecules
~ 31 ~
questo isomero viene irradiato con luce UV (λ~340 nm), esso subisce una conform azione e diventa cis -azobenzene, in cui un gruppo feni le ruot a ris pet to al suo gruppo azo di circa 55° ( Figura 8.B ) con un momento dipolare di 3 D [38]. Tal e i s omero rit orna all o s tato di equilibrio per ril as s am ento t ermi co s e posto al buio o s e vi ene irradiato con λ maggiori di 450nm.
Dal mom ent o che il rilass am ent o t ermico de l cis -azobenzene ri chi ede divers i giorni a t em peratura ambi ent e ed al bui o [38], sono st ati ingegnerizzat e diverse e numerose vari anti di azobenzene . Tali derivati poss ono i someri zzarsi i n m ani era different e rispetto all’originale [37] [39] ed a lunghezze d’onda più red-shifted, in modo da ass orbire l uce a profondit à m aggiori nei t es suti nervosi , senza apport are danni . Element o chi ave dell ’azobenzene e dei suoi derivat i è che essi non vengono modi fi cat i o degradat i dal sis tem a bi ologi co , sia in vitr o che i n vi vo.
Infine, nell’ambito di st udi neuros ci entifi ci , ques te vari anti di azobenzene vengono appli cat e, da una est remit à, a recettori, in genere canali i oni ci, e dall ’alt ra, ad un neurot rasm ettit ore agonist a/ ant agonist a o poro bloccant e .
Perciò, i derivati , in funzione dell a l uce, ass umono una cert a posi zione ris petto al recett ore e, di conseguenza, sono in grado di controllare l’apertura dei canali ionici innesca ndo depolarizzazioni o iperpolari zzazion i. In genere , t ali ligandi funzionano molto bene s e legati a canali vol taggio K+ ed a recett ori glut amm ato [13] .
Questi com pl essi di ligandi fot os ensi bil i si poss ono di videre i n due macrogruppi, in bas e al la necessit à di una mani pol azione geneti ca [33] [28]: li gandi liberam ent e diffusi (PCLs , Figura 9.A) e legati per affi nit à (P ALs , Figura 9.B), e li gandi
Figura 9
Current Opinion in Neurobiology - Precise modulation of neuronal activity with synthetic photoswitchable ligands
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legati coval ent em ente ai siti di att acco desiderato, int rodott i geneti cam ent e ne i recettori bersaglio , senza che vi si ano alterazioni dell e funzioni origi nari e (P TLs , Figura 9. B).
PhotoChromic Ligands (PCLs)
I PC Ls non ri chiedono una terapi a geni ca, perché si t ratt a di ligandi liberam ent e circolanti che, una volta int eragit o con i recett ori speci fi ci, si dissoci ano da essi i n funzione dell a luce.
I PCLs poss ono com port arsi si a com e t rans -bloccanti o cis -bl occanti: i primi i nducono segnali nervosi s e si fotoisom erizzano, m ent re i secondi, i n mani era invers a, inducono s egnali nervosi i n ass enza di luce [33] [28] [40].
I PC Ls, grazi e alla s empli cit à e all ’ abbondanza chimica dell’azobenzene, sono stati i pion ieri della fotostimolazione ottica nei primi studi neurosci entifi ci d ell a fi ne degli anni ’60 [41] [40] . Tali studi si ri ferivano al PCL bis -Q, un agonist a phot oswitch per il recettore acetil col ina. In s eguito , sono stati progett ati di fferenti PCLs i n grado di controll are l e atti vità neuronal i t ramit e canal i ioni ci volt aggi o-dipendenti , incluso canali K+, Na+ e C a2 + e recettori glut amm ato come AMPA, NM DA e Kai nat e, pri ncipali recett ori che medi ano l a neurotras missione eccit atori a [40].
Generalm ent e, però, i PCLs sono l iberam ent e ci rcol ant i i n am biente fisiologi co, perciò, possono diffondersi e legarsi a recett ori di cellul e o subregi oni che non sono oggetti di s tudi o.
Photoswitchable Tethered Ligands (PTLs)
Allo s copo di mi nimi zzare l a possibili tà di int erazioni non desi derat e ed aum ent are la concent razione locale del ligando, al ternati v am ent e ai PC Ls, poss ono ess ere utili zzat i i P TLs. Sviluppat isi parall el am ent e ai pri mi, i P TLs cons entono di essere legati coval entem ente ai recettori speci fici , ma a patt o che part e del gene che codi fica t al e recettore venga tratt ato et erologam ent e, per es primere anche un sito di affinit à al ligando speci fi co.
Il pri mo compl esso recett ore -ligando ingegneri zzat o è st ato SP ARK22 [31], un derivato dell’azobenzene a cui è l egato il poro bloccante
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(MAL -AZO-QA). Appli cando un sito di affi nit à per mut azione al canale pot ass io volt aggio di pendent e Shaker, SPAR K è in grado di legarsi ad es so . Nel l a trans -confi gurazi one, SP ARK bl occa il canal e ionico e si fotoisomerizza rapidamente (<100ms) con λ~380 nm ; ciò com porta un increm ento dell a con duttanza di ioni K int racell ulari ed una cons eguent e iperpol ari zza zi one del neurone.
Dopodi chè, SP ARK ritorna allo st ato di equilibrio: s e posto al bui o , il ril ass am ent o t ermi co può impi egare olt re 10 min; m ent re, s e vi ene esposto ad impulsi di luce visibi le (λ ~500 nm), il ritorno all o stato inizi al e può ess ere accelerato fino a 2 mi n [31]. A causa delle el evat e durat e d el ril as sam ento t ermico in entramb e l e condi zioni , assenza o pres enza di luce, quest o compl esso non è, t utt avi a, utili zzabile per controllare atti vit à nervos e.
Un compl ess o recet tore -ligando che, i nvece, ha ri cevuto molt a att enzione s oprattutt o da part e del l e neurosci enze, è il LiGl uR [42] [43]: si t rat ta di un recett ore i onot ropi co glut amm ato modifi cat o (iGl uR6) i n una s ubunit à specifi ca, al qual e si l ega il l igando azobenzene derivato MAG0
(Figura 10.A), a sua volt a agganci ato al neurot rasmettitore glut amm ato.
La dirett a fot oat tivazione di t al e com plesso offre l a possibi lit à di depol ari zzare, t ramit e pot enzi ali postsi napti ci eccit at ori glut amatergi ci , i neuroni in
vi vo23 in m ani era prati camente
correl at a al treno di impul si luminosi, con frequenze fino a 50 Hz.
23 Gli studi [33] [42] riportano che su una coltura di neuroni ippocampali murini e su pesce zebra, la
fotoattivazione di LiGluR innesca APs correttamente con treni di impulsi luminosi fino a 50 Hz; mentre lo studio [28] , effettuato sulla corteccia V1 murina, riporta che impulsi luminosi guidano spikes con frequenze fino a 5 Hz.
Figura 10
Frontiers in Molecular Neuroscience - A Toolkit for Orthogonal and in vivo Optical Manipulation of Ionotropic
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Quest e frequenze ri ent rano nella scal a temporal e fisiologi ca dell e attivazioni dei recett ori glut amm ato.
Grazie al la p ropri et à caratteris tica bist abil e dei derivati di azobenzene, ill uminando il Li Gl uR a lunghezze d’onda di fferenti , è possi bil e aum ent are o di minui re l a conduttanza in mani era controllata; quindi, i l tempo di eccit azione è precis am ent e defi nit o in funzione degl i impul si lumi nosi .
Un’ulteriore caratteristica di LiGluR è la possibilità di innesco di un AP con un breve m a i ntenso i mpul so l umi nos o, s eguito, da altri brevi ma deboli im pulsi lumi nosi che i nnescano ulteriori APs, sfrutt ando il ril ass am ento t ermi co piuttost o prolungat o in prossimit à dell e spi ne dendri tiche. Tutto ci ò prosegue f i nchè non si utili zzano i mpulsi a lunghezze d’onda maggiori o in attesa che si completi il rilassamento termico (~18 mi n). L’aspett o negativo di questo approcci o t anto att raent e, è che la versione dell ’azobenzene MAG0 (Figura 10.B )
richi ede un’i rraggi ament o UV (380 nm) per il pass aggio t rans -cis, e per il ritorno inverso luce visibile (λp e a k = 600 nm) o rilass ament o
termico di di versi mi nuti.
La versi one MAG4 6 0 (Figura 10 .C), invece , ri chi ede un i rraggiament o
più red -s hift ed (λp e a k = 460 nm ) per il passaggio t rans -cis e ritorna
allo st ato st abil e trans sol am ent e con ril assam ent o t ermico al buio di divers e centi naia di millis econdi [33] [28].
Photoswitchable Affinity Labels (PALs)
I P ALs s ono m olto simili ai PTLs , con l’unica di fferenza che sul recettore specifico, i l sito di affi nit à per il com pl esso phot os wit ch -ligando s peci fi co è endogeno e , quindi, non è necess ari a alcuna modi fica geneti ca [44]. La m aggior part e dei PALs s i lega coval ent em ent e a s pecifi ci canali K+, m a questo approccio risul ta utile anche per ini bire attività neuronal i trami te recettori GAB AA
[45] o st udi are attivit à e cineti che dei recettori GPCR s [46], recettori che present ano gi à si ti di affi nit à ai P ALs.
Tutt avi a, quest o approccio non è molt o esplorat o nell e neuroscienze, tant o che il present e lavoro non ha t rovat o alt ri studi neuros ci enti fi ci al riguardo.
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Studi recenti: osservazioni ed innovazioni
La fotochimi ca, che vanta un s ettore sci entifi co ris ale nt e all ’epoca indus tri al e e qui ndi pioni ere di i nnumerevoli st udi , è uno dei possibili approcci con cui si poss ono cont roll are , tramit e la luce, le attività nervose. È, però, merito d el progress o tecnologic o degli ultimi decenni , s oprattutt o i n rel azione all a mi croscopi a laser 2P [31] , s e la fotochimi ca ha guadagnat o il ri conos cim ent o di cui oggi gode nel campo dell a sti mol azione ott ica .
Ess a, i nfatt i, cons ente di alt erare t ram it e l uce, con una ris ol uzi one spazi al e m ai raggiunta i n passato, le st rut ture di m olecole chi miche, che hanno dimensi oni inferiori di diversi ordi ni di grandezza rispetto a quelle dell e protei ne o dell e cellule.
Pochi sono gli st udi rel ativi all e neuros ci enze che fanno us o di questo approccio fotochim ico ricorrendo ai complessi photoswit ch -li gando; la m aggior part e degli st udi, invece, prevede il ri corso a neurot rasm ettit ori caged fotoattivabi li per i diversi int rinseci aspet ti vantaggiosi .
Innanzit utto, i caged fotoatt ivabili non ri chie dono al cuna espressione genica es ogena e, quindi, nessuna t erapia geni ca .
Nonost ant e ci ò, consent ono di st udi are , mappare e m ani pol are le connessioni funzionali dell e si napsi con una precisi one spazi ale e temporal e non paragonabil e a quel la degli alt ri approcci, optogeneti ca compresa ; è poss ibil e regol are i pot enzi ali a livello di singola si napsi da rem oto anche dopo diverso t empo dall ’introduzione d ei neurot rasmettitori caged , per m eri to anche degli svil uppi dell a mi cros copia l as er 2P. Grazie al la not evole m odell abili tà dell e gabbi e, l a loro ingegnerizzazione è un s ettore in conti nuo ri nnovamento ed ogni anno vengono pubbli cati num erosi st udi i n m eri t o. P er di più, l ’avvento degli idrogel [36] ha perm ess o di ingegnerizzare gabbie biodegradabili e biocom pati bili , il che ha reso questo sett ore di ricerca molto più att raente di quanto non lo fosse una decina di anni fa.
Un ult eriore motivo che giusti fica questa continua ingegnerizzazione è l’int eres se che ess a susci ta anche i n al tri sett ori di ricerca che si
