Gli enormi s viluppi dell ’optogeneti ca hanno s ost enut o e sost erranno ancora num erosi set t ori di ri cerca , com e la rigenerazione dei tess uti e lo sviluppo di im pianti bi oni ci ot tici , che possono ripris tinare funzioni s ensoriali come l a vist a [103] e l ’udi to; ha nno rivoluzionato gli approcci di studio, i n parti col are nel l e neuros cienze , perché offrono l a poss ibilit à di studiare sist emi com plessi com e il cervell o mammi fero con una precisi one spazial e e t emporal e m ai raggiunt a prim a, si a in vit ro che i n vi vo; inoltre, gl i svil uppi nell ’optogeneti ca consentono di evit are l’uso di agenti farm acol ogi ci come GAB A recettori agonisti e bloccanti canali sodio -potassio, che poss ono avere pesanti ri cadut e ed effetti coll ateral i, e l’uso di quell e t ecni che imprecis e ed i nvasi ve come il raffreddam ent o l ocal e e l’inseri ment o di elet trodi/pipett e .
Per es empio, il fatto che si possono i ntrodurre nell e cellul e vett ori virali cont en enti geni che codi fi cano si a ChRs che NpHR, ha reso pi ù facil e lo st udi o di det erminati circuiti neurali , dal m oment o che riescono a coesist ere in m ani era perfett ament e s tabil e e a ri s pondere a lunghezze d’onda differenti, formando un sistema completo multimodal e , ad al ta vel ocit à e geneti cam ent e mirato [74]. U no studio [73] ha riport at o ch e, trami te quest o approccio , è possibil e controllare la locomozione bidirezional e de i mus coli e dei motoneuroni coli nergici del verme C aenorhabditis el egans , att ivando anche contemporaneament e si a NpHR s che ChR2s50. Alt ri st udi fanno ricorso a simil i approcci , uti lizzando m odelli anim ali com e topi o moscerini dell a frutt a Drosophil a [104] per lo studi o dei neuroni che guidano la fame o l’apprendimento avversivo.
Uno studio [52] effett uat o sui topi , il cui vi deo è divent ato rapidam ent e viral e, ha m ost rat o l ’effi caci a dell a sinergi a t ra l a tecnol ogi a el ett ronica -i nformat ica e l ’opt ogenetica; t al e s inergia h a perm esso di contraddire di verse i pot esi riguardo un’area cerebrale
50Quando ci sono impulsi con lunghezza d’onda del blu, si attivano ChR2s provocandone depolarizzazioni e
di conseguenza APs; mentre, quando ci sono impulsi con lunghezza d’onda del giallo, si attivano NpHRs provocandone depolarizzazioni. Nel caso ci fossero impulsi di entrambe le lunghezze d’onda, non si innescano APs.
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rit enut a respons abil e del comport am ent o s ess ual e; indagando t ali circuiti neurali (medial preopti c area MP A) che si proi ett a no poi su ventral peri aqueduct al gray (vP AG), si è ril evato che in realt à essi sono im pli cat i nel comport amento predat orio /ludi co e non in quello sess uale . Nel t opo vengono int rodotti AAVs cont enenti l e ChR 2s con rel ati vi promot ori, m irati ai neuroni del MPA; sull a sua t est a vi ene, inolt re , installato un microcont rollore dot ato di di spositivo bl uetooth e di fi bra otti ca per st imol are i neuroni , cont roll ati da rem oto; al microcont rollore è collegat o anche un s ervomot ore che cont rol la una palli na che funge da obi ettivo/preda (Figura 22 .B). Il topo , sotto stimol azione indott a, riesce ad oltrepas sare tutti gl i ostacoli incont rat i i ns eguendo la preda -pallina gui dat a da ll ’algoritm o - operatore est erno , i n un int ervallo tem poral e nett am ent e i nferi ore rispett o a quello che im piegherebbe nel la s tes sa sit uazi one ma i n assenza di stim ol azi one indott a51 (Figura 22.A).
L’analisi di rapidi treni di spikes in risposta a impulsi luminosi medi ati dall a prot ei na f -C hrim son, svol ta nell ’am bito di un alt ro important e studio [77], ha riscont rato che il cont roll o remot o otti co attiva gli i nterneuroni posti nell e cortecce cerebrali; t ali neuroni sono caratt erizzati da notevol e rapidit à nei l oro fisiol ogi ci limiti intri nseci .
51 Object only: 00;07;45 Object+LED: 00;00;46 (hh;min;sec)
Figura 22
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Lo stesso t eam del lo st udi o [77] ha proseguit o i ntroducendo f- Chrim son in t opi affet ti da sordit à acut a t ramit e mi croiniezioni di AAVs in s cal a tym pani e ha rilevato per 9 mesi dall’i ni ezione una el evata ed omogenea espressi one di f -Chrimson s ui neuroni nel 80% del SGNs (S piral Ganglion N eurons) dell’orecchio t ratt ato ; nell’orecchio non trattato, invece, l’espressione della stessa proteina si è pres ent at a in m eno del 5% del S GNs, m olto probabilm ente a caus a dell a di ffusi one dei vettori vi rali at traverso il li quido cerebrospinal e. Per ri dur re t al e percentual e, in fut uro s aranno ri chi est e ottimi zzazioni nei protocolli di ini ezione di vettori vi rali. Infine , il team ha s timol ato , tramit e fi bra otti ca a si ngolo canal e , le vie uditiv e di topi si a s ani che sordi , osservando che t utti ris pondevano agli impulsi emessi fino a 1kH z.
In conclus ione, lo studio non ha ri levato evidenze di effet ti coll at erali , tutt avia, ci si aspett a un m ini mo di fotot ossi cit à dovuto allo s pettro red -s hift richiesto dall a f-C hrim son. Per t anto, f- Chrim son è ad oggi rit enut a una candidata m olto prom ett ente per l e future t erapi e cli niche optogeneti che, com e quell a per il riprist ino di funzioni sensori ali.
Ult eri ori s tudi [4] [77] [87] [105], effet tuati su popolazi on i di neuroni dell e vi e uditive dei topi , confermano e prom uovono l’uso della stimolazione nervosa mediata dall’optogenetica , speculando la fabbri cazione di pot enzi ali impianti cocleari otti ci (oCls ) . Questi dovrebbero ess ere costitui ti da una s eri e di centinai a/migl i ai a di microl as er posti nel canale di Rosenthal , ognuno dei quali andrebbe a stim ol are t onot opi camente un range m olto pi ù ridot to di neuroni uditivi , ri spetto a quanto fanno i convenzi onali impi anti cocl eari el ettrici , che con 8-20 el ett rodi s timol ano i nt eri gruppi di neuroni , riducendone es ponenzi alm ent e l a qualit à sonora.
Tutt avi a, nonos tante che abbi a perm ess o i l raggiungim ent o di grandi traguardi, l ’opt ogenetica non m anca di qual che as petto negat ivo: lo studi o [106], infatti, fa notare che l a foto -eccit azi one di sottopopolazi oni di neuroni cont enent i C hRs, può int erferire con l e attività di alt ri neuroni adi acenti , i quali potrebbero port are ad effett i inaspettatam ente indesiderati .
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È st at o, ad es empi o, osservat o i n m acachi V1 che le dinamiche sinapti che d ei neuroni fotostimolat i possono influenzare fort em ent e i profil i dell a ri spost a on -s et l as er, che co mprendono l a l at enza e i l rapporto t rans itorio -mant eni mento, e i profili dell a rispost a off -set las er, che comprendono l a off -cineti ca e gli effet ti soppressivi post - stimol azione.
L’optogenetica ha offerto molte strade a numerosi settori di ricerca, ma ci ò è st ato possibile anche grazie ai s ostanzi ali sviluppi apport ati all e t ecnol ogi e neces sari e per una corrett a appli cazione dell’optogenetica, come le fibre ottiche per fotostimolazione e la micros copia otti ca hi gh -speed per il det ecting [50] [107].
Combinando stimol azione otti ca con microscopi i mpi ant abi li o a fibra ottica, si pot rebbe gi ungere allo svil uppo di int erfacce neurali ottiche, l e quali potrebbero si a ricevere informazi oni afferenti - sensoral i t ramit e fot ostimol azione di C hRs , che invi are informazioni efferenti-m otori e tramit e fl uorescenza di GEVIs , ril evate dai micros copi posti in disposi tivi bionici [11].
Va sott olineato, infat ti, che l e prest azioni dell e prot eine fot osensibili non dipendono solo da ess e s tes se , m a anche dall a t ecnologi a utili zzat a dal det ect i ng /stim ul ating .
Nuovi vettori vi ral i pot ranno ridurre le rispost e immunitari e, migliorare la s el etti vi tà e m antenere una espressione t rans genica nell e cellul e a lungo termine.
Nuove prot ei ne opt ogenetiche pot ranno poss edere una maggiore gamm a dei col ori , diminuendo l a sovrapposi zione spett ral e e migliorare l a ci net ica e il rapporto segnal e -rum ore (S NR).
Nuovi microscopi , i n parti col are i mi croscopi opti cal s ecti oning, potranno migli or are flessibilit à, stabilit à e risoluzione -profondità di imagi ng, i ndi viduare mol ti più fot oni emessi per fluores cenza ed essere di dim ensi oni così ridott e da di venire port abi li.
Questi s ono gli el ementi chiave per apport are ult eriori mi gliori e e sviluppi nell’optogenetica, per raggiungere i quali sono necessari nuovi st udi, ri cerche ed investim enti.
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Radiazione Infrarossa
La neurostim olazi one m edi at a dall a luce infraros sa (INS ) è un approccio che viene prati cat o da di verso t empo come alt ernati va agli approcci precedent ement e des critti : sviluppat a da Duco J ans en [108] e da J onath an Wells [109] in paral lel o al progres so dell ’optogeneti ca di cui non ha ris coss o, però, gli st essi successi [2], IR comprende una larga porzione della radiazione elettromagnetica con un range di λ com pres a t ra 780 nm e 1000 μm.
Secondo lo st andard ISO 20473:2007 Opti cs and phot oni cs – S pect ral bands [110], la banda del la radiazione infraross a può ess ere di visa in tre sottocat egori e : l a banda del Near -IR (0.78 –3.0 μm ), del M iddl e- IR (3.0–50.0 μm) e del Far-IR (50.0–1000.0 μm ).
Va s peci fi cat o che t ali sottocategori e vanno ben disti nt e, perchè, per es empi o, t ra i l NIR e il FIR ci sono di fferenze ass ai si gni fi cative in quanto lo spett ro di ass orbim ento da part e dei t essuti (acqua, lipidi, prot ei ne, aminoaci di, et c) varia in funzione dell a struttura del t ess uto stesso. Di cons eguenza, gli effetti sui tessuti possono vari are considerevolmente in funzione della lunghezza d’onda della radi azi one el ett rom agnetica , m otivo per cui l e caratteris tiche ottiche non pos sono ess ere defi nit e i n egual misura . Tutt avi a, va consi derato anche che in general e le mo l ecol e assorbono t ali radi azioni e l e riemettono a lunghezze d’onda differenti dalla sorgente iniziale. Proprio perché l a maggioranza di queste mol ecol e è pressochè pres ent e in tutt e le
cellul e, quest e sono sensibili ad am pi s pett ri dell a radi azione infraross a, facendo di
quest’ultima una
applicazione con una precisione e risol uzione spazi al e più el evat a rispett o a t utti gli alt ri
Figura 23
Biophysical Journal - Biophysical Mechanisms of Transient Optical Stimulation of Peripheral Nerve
~ 63 ~ approcci precedent ement e t ratt ati.
Infat ti, il gruppo di Wells, che è st ato t ra i prim i ad investigare in maniera scrupolosa le potenzialità di quest’applicazione, ha evi denzi at o che il profil o dell a t emperat ura segue una dist ri buzi one Gaussiana nello spazio bidimensionale del tessuto esposto all’IR (Figura 2 3) util izzando una fibra otti ca di di ametro 600 μm (di stanza fibra-t ess uto 0.5 mm ) [14]. Da quest a curva, si evi nce che gran part e dell’energia dell’esposizione radiante è confinata in un’area del tessuto di diamet ro ~ 200 μm .
Wells fa not are che , se si us assero fibre ottiche dai diamet ri i nferiori , pur mantenendo un’intensità dell’energia r adiante tale da stimolare i neuroni, si potrebbe ott enere una precis ione s pazi al e ancora maggiore52 e che i l res pons abi le della generazi one di APs a fronte di impulsi IR potrebbe ess ere il gradi ente di tem peratura .
Per quant o riguarda la precisi one t emporal e, i nvece, t rami t e brevi (che può ess ere dell’ordi ne d al fem tosecondo al m icrosecondo ) impulsi di l uce infrarossa, i neuroni poss ono depolari zza rsi o iperpolari zzarsi i st antaneam ent e, anche s e, in quest’ultim o caso, sono necess ari ult eri ori st udi vi sto che si t rat ta di un t raguardo per anni ritenuto incompreso ed i rreali zzabil e, ma ri scopert o sol o recent em ent e [111].
Contrariamente all’optogenetica o all’introduzione di materiale esogeno, com e NPs o array di el ett rodi , INS non ri chiede al cuna operazione invasiva e ci ò l a rende un ottimo candi dat o per la neurostimol azione , perché non esi ge un cont att o diretto tra l a sorgente INS ed il tessut o nervoso, pur mant enendo el evat a l a risol uzione spazial e tipica53 della neurosti molazione ott ica [2]. A ci ò si aggiunge che INS present a anche alt ri aspetti molto vantaggiosi : è economica e, sopratt utto, eccezionalm ente fles sibil e, al punto che si p os sono us are si mult aneamente INS e recording EEG/MR I s enza che la prim a generi art efatti [2] [112] [113] durant e la regist razione , cont rari am ent e a quant o succede nel caso di el ett rodi
52 Per limitazioni fisici e tecnici, non è possibile utilizzare fibre ottiche dal diametro inferiore a 4 μm 53 Spot di illuminazione 100-400 microns in diametro
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che, i nvece, int erferiscono con le att ivit à elet trofi siologi che e, di conseguenza, con l a regist razi one.
Ciò che i nnes ca INS sui neuroni è un fenom eno che opera a livel li più basi ci ris pet to al l e sue alt ernative; l a conseguenza più evi dente è il ril as cio di calore in un lasso di t empo molt o breve , il gradi ent e termico, che vi ene poi rapi dam ente assorbi t o e dis pers o nell ’am biente circost ant e e, c onsiderando che l’ambiente ext racellul are è caratt erizzato da un conti nuo ri circolo di flui di e rimodel l am ento dell a m atri ce extracellulare , t ale dispersione è ancora più veloce, con un ris chi o minimo di danni all e cellul e derivant e da accumulo eccess ivo di calor e.
Tutt avi a, s i deve fare att enzi one a non utili zzare i mpul si IR dai gradi enti termi ci che inducano all e cel lule di avere tem perat ure vici ne a quella dell a denaturazi one proteica (55 -56 °C); in genere, dagli st udi si oss ervano aum enti di t em peratura fi no a 10°C dalla temperatura bas eli ne per avere una stim olazione effi cace; ment r e primi danni t erm ici s i oss ervano ad aum enti t ra 18°C e 20°C .
Num erosi sono i param et ri che perm ett ono una buona e corret ta effi caci a del INS [111]: prim ari ament e, l’irradi anza, e , a s eguire, l’intervallo di tempo, la modalità di trasmissione (ad onde continue o ad impulsi ), la lunghezza d’onda dell a radiazi one infraross a coi nvolt a e la frequenza di impulsi .
Quest’ultimo è un parametro critic o, perchè si possono indurre effetti molto di fferenti; infatti im pulsi a bas se frequenze consentono INS ; in quanto il calore ri sult ant e i ndotto nei t ess uti dagli impulsi stes si , si dis perde i n t empi adeguati vi a conduzi one termi ca. Al cont rario, gli effetti provocati dagli impulsi ad alt e frequenze si sovrappongono, aum ent andone l a t emperat ura com pl essiva , i ncrem ent ando, di conseguenza, il ri schio di apport ar e danni termi ci ; in questo modo, anzi ché stimolare neuroni, si t ende ad ini birli; t al e vari ante di INS è definit a come Infrared Neural Inhibiti on (INI).
Un num ero sempre m aggiore di st udi riporta che , proprio grazi e a t ali paramet ri, IR trova spazi di applicazione in vari sett ori sci entifi ci , quali l ’ingegneri a ti ssutale o l ’oncol ogi a; la capacit à di aum ent are l a temperatura i n s edi speci fi c he accelera, ad es empi o, il processo di
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rigenerazione cellul a re [114] da ferit e e coadiuva i tratt am enti contro vari e form e di cancro [115] [116] ed in caso di m al atti e neurodegenerative come il P arkinson [117].
Altri studi riport ano che IR è in grado di preveni re ed al levi are dolori, rigi dit à, s tanchezza da art rit e reumatoide e s pondilit e anchil osante, di t rat tare di sordini oft alm ici , neurologici [118] [119] [120] e psichi atri ci , di s ti molare l a proli ferazione di cell ul e st aminali mes enchim ali e cardi ache e, infine, di pot enzi are l e terapi e fotodinami che [121] [111] .
Con ult eriori es tensi oni e d opportune rifiniture t ecni che, INS ha la possi bilit à di divent are un pot ent e e versat ile st rum ento per la ricerca di bas e t ant o quanto per l e appli cazioni cl iniche.
Sebbene l’uso del IR sia promettente in numerose applicazioni, questo approcci o non è es ent e da al cune limit azioni, che s ono perlopiù as sociat e al l’int erazi one l as er -t essuto .
Infat ti, al cune bande IR , a dos aggi energetici eccessi vi, possono essere assorbit e da l sangue, in parti colare da emogl obi na, e da molecole dell’acqua [21], pressoché onnipresenti in tutti gli organi smi. Ciò fa sì che, con l’aument are dell a t em peratura i nterna dell a cell ula , accres ca anche il rischi o che quest a si danneggi o espl oda [2].
Un’altra limitazione è la forte dipendenza che intercorre tra la profondità spaziale e le proprietà dell’assorbimento IR dei tessuti [122] .
Perciò, s e da un l at o INS si presenta come un approcci o versatil e, dall’altro risulta potenzialmente dannosa e, quindi, esige di un’attenzione minuziosa circa la scelta dei parametri , in particolare se l a stimolazione è dirett a al cervell o. In genere, per la neurostimolazione ottica si scelgono lunghezze d’onda con coeffi ci ent e d’as sorbimento dell’acqua minim o ; ciò perm ett e di ottenere una conversione energi a l aser -calore efficient e , purchè vengano generat i APs, com e afferm ato dall o studio [109] e, successi vamente , dal lo st udio [108] , ent rambi effettuati con rapid e transi zioni di calore in un nervo sciat ico di ratt o .
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Infatti, per un coefficiente d’assorbimento dell’acqua di ~115 cm- 1,
corri spondent e a λ ~ 1.94 μm , la profondit à di penet razione è di circa ∼85 μm; mentre, per coefficienti d’assorbimento di ∼10 cm− 1 corrispondenti a λ~1.85 μm, la luce può arrivare fino a ∼1000 μm [123] .
Lo st ess o studio riport a anche il valore di sogli a dell ’energia di esposi zione (∼0.3 J/cm2) per cui si gener ano APs senza che ci siano danni di natura termi ca, a s eguito di i mpulsi con int ervalli di t empo com presi tra 0.25 ms e pochi millis econdi .
Si può concludere che bi sogna rispet tare un confi nam ento t e rm ico temporal e (500 ns < tp u l s e <200 ms) e s pazi ale, affi chè l’energi a ottica -
termica di un impul so si accumuli nel t ess uto irradi ato pri ma che questa si dis sipi attraverso la conduzione o l a convenzi one, in modo da generare efficacement e APs [14] .
Sebbene alcune strategi e di stim olazi o ne otti ca si ano medi at e d a interazi oni fotochimi che, gli impulsi emes si da sorgenti l as er IR non sono in grado di fare altrettanto, anche perché l’energia di un singolo fotone em es so da una tipi ca sorgente IR è signi ficati vament e inferiore di di versi ordini di grandezza ri spet to al l e energie ri chi est e per s post are un el et trone ad uno st ato energetico s uperiore, com e succede nell e reazi oni fotochi miche.
Per esempio, l’energia di un singolo fotone emessa dalla sorgente Ho: YAG è di 0.58 eV, valore che corrisponde ad una energia di legam e di 52 kJ/mol . D’altra part e, l e energi e di legame tipiche di uno ione hanno un range di valori compresi t ra 100 e 1000 kJ/mol [5].
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