Gli st udi del INS effet tuati s ul P NS s ono più cons ist enti ris pett o a quelli effettuati sul CNS, m a le ragi oni di questo divari o sono dovut e all a s empli cit à del la di sposizione t ri dimensionale dei neuroni afferenti ed efferenti . Q uest’ultimi , infatt i, sono o rgani zzati i n fi bre di assoni e le loro atti vazioni m edi ante IR sono m aggiorment e evi denti, in quanto l a maggior parte di essi corrispond e a neuroni motori e, quindi, l e rispost e sono vi sibili dirett am ent e nei moviment i muscol ari , che poss ono ess ere misura ti quantitativam ent e att raverso el ettromiografi a (EM G).
È proprio per quest a caratt eri sti ca anatomica che il gruppo guidato da Well s è ri uscito a provare su nervi sci ati ci di ratt o i n vi vo per l a prim a volt a nel 2005 [108] che l a radiazi one infrarossa è in grado di
59 I segnali BOLD sono proporzionali all’intensità del INS
Figura 29
NeuroPhotonics - Infrared neural stimulation: a new stimulation tool for
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stimol are e m odul are ri sposte nervose nei neuroni , s enza che vi si ano danni ti ssut ali . S uccessivam ent e, il medes imo gruppo ha approfondit o i val ori minimi dell ’energia radiant e per ci as cuna lunghezza d’onda necessari affinché si evocassero APs, determinando così i valori di sogli a di stimolazione e conferma ndo una rel azione lineare tra quest a e l e rispost e C NAP s [138] .
Questi iniziali studi avevano messo in luce l’importanza di questo approccio di stimolazione anche per merito dell’assenza artefatti durant e una regi strazione el ett rofis i ologica, tipi cam ent e presenti durant e la stim ol azi one el ett ri ca, com e precedentemente spi egato. Un ult eri ore os servazione che è stata fatt a, a dim ost razi one dell ’elevata precis ione spazi al e del INS, è che i valori rilevati el ettrofisiol ogi camente s ono quatt ro volt e inferi ori ris petto al caso i n cui si è fatto ricors o agli el ettrodi . La ragione di ciò è dovuta dal fat to che m eno neuroni sono coinvolti nel la stim ol azione e mi nore è rispost a nervosa indi viduat a. [9]
Un ulteriore st udio [151], utili zzando un different e m odello animal e, il coniglio, di cui i nervi peri ferici , in particol are quelli motori, hanno dim ensi oni m aggiori in di am et ro rispett o ai m odelli animal i murini, ha dimostrato che INS (1875 nm) mantiene l’elevata precisione s pazi al e anche in anim ali differenti . Per cont ro, però, è stat o ris cont rat o che sono
pochi i muscoli che mostrano ris pos te motori e a front e di una s timol azione a singolo canal e s ui nervi motori a cui sono congiunti tali mus coli . Va specifi cat o che si t ratt a di una INS ext raneural e60 appli cata su un nervo periferico multi -
fasci colare, perciò solo quei nervi superficial i s ubiscono energi e di esposi zione radi ante suffi ci enti ad innescare rispost e motori e.
60 INS extraneurale consiste di stimolare selettivamente i neuroni senza che la fibra ottica penetri nel tessuto:
nel caso del nervo motorio, non c’è la penetrazione nel epineurio o perineurio.
Figura 30
Implantable infrared nerve stimulation devices for peripheral and cranial nerve interfaces
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Tutt avi a, ciò s uggeri sce che, per una INS progett at a a poss ed ere più canali di sti mol azione che ci rconda una part e del nervo mot orio, si poss ono evocare ri sposte mot ori e con m aggiore effi caci a e controllo. A riguardo di ciò, Wells stesso, insi eme ad altri coinventori , ha brevett ato questo t ipo di INS multi canali (Figura 30 ) [152]: pot enzialment e pot rebbe ess ere usato si a per far recuperare funzi oni motorie in pazi enti affetti da paralisi dell e arti che com e dis positivo per interfacce brain -com put er (BC Is).
Come ci si può aspettare, le lunghezze d’onda tipiche per una stimol azione dei neuroni peri feri ci, non sono l e st ess e dei neuroni appartenenti ai tessuti corticali: gran parte dell’energia radiante viene assorbit a dall e guain e mi elinic he che ci rcondan o gl i assoni dei neuroni peri feri ci i n molte dell e l unghezze d’onda ti pi che del CNS. Perciò, non s olo sono necessari m aggiori quantit à energi a, m a si è cost retti anche ad utilizzare radi azion i con lunghezze d’onda che vengono in gran m i sura assorbite da m olecol e ben pres enti nell e cellul e com e l’acqua, aum ent andone, di cons eguenza, i ris chi associ ati ai danni dovuti per abl azione t ermi ca.
Come nel cas o del CNS, att ravers o prove it erative speri m ent ali effettuat e in vitr o, s i è cons tat at o che l a lunghezza d’onda con i l rapporto t ra la s ogli a stimolazione e l a sogli a dei danni pi ù s icuro è di 2.12 µ m [5] [138].
Tuttavia, altri studi hanno investigato differenti lunghezze d’onda per com prendere ult eriorment e i meccanismi che s ono all a base del INS, anche se l a maggi or part e di essi hanno most rato una durat a della depol ari zzazi one di membrana signifi cativam ent e pro l ungata che vari a da 100 ms ad alcuni secondi.
Considerevoli sono i ris ult ati ottenuti nello studio di Kat z [153]: att ravers o la stimol azione (λ = 1889 nm) appli cat a su di fferenti neuroni som at os ensoral i in vitro proveni enti da ratti, ovvero neuroni del ganglio dell a radi ce dorsale (DR G) e neuroni del ganglio nodosum (NG), si è pot uto os servare che l e risposte nervose ad essa deri vata sono simili , nonostant e l e different i funzi onalit à dei neuroni (meccanosensibi le e nocicetti vo rispetti vam ent e) e l e di mensi oni del loro som a. Questo fa dedurre che i m eccanismi del INS avvengono a
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livel lo non cellul are ma subcel lul are e che non s ono m ediat e da specifici rilasci di neurotrasmettitori. Inoltre, un’altra importante oss ervazione, che in part e va a confut are l ’ipotesi dell ’at tivazi one di quei canali cat ioni ci fotos ensibil i , in particol are quelli appart enenti all a fami gli a del TR P [126] , è che quest’ultim a pot rebbe non ess ere in realt à i l princi pal e respons abil e dell’i nnesco di APs a fronte di impulsi IR; infatti, ad es em pio, meno del 38% dei neuroni NG e del 32% dei neuroni DR G esprimono il TRP V1.
Per quanto ri guarda INS appli cat a s u P NS di pazi enti umani, sono molto carenti gli s tudi condotti su di essi , nonost ant e l ’ormai dimost rata si curezza di quest a t ecnologi a ; d’altronde, solo recent em ent e, sono stati ott enuti per l a pri ma vol ta ri sult ati da pazi enti um ani affet ti da paralis i cerebral e , sott oposti a rizotomi a dorsal e s elet tiva (SDR) per il t rat tam ento della spas ticità refratt ari a [154] .
Le radi ci dorsal i um ani sono dim ensionalment e simili a quel le dei nervi sciat ici murini e l e propriet à otti che tra questi due ti pi di nervi non vari a s igni fi cati vam ent e , perci ò possono es sere rit enuti un buon modello per cui dimostrare l e carat teristi che tipiche del INS , quali l a precisione s pazi al e, sicurezza e l a m ancanza di art efatti anche su tessuti nervosi um an i.
Dopo aver es eguito il prot ocollo del SDR61 (ES : 1-10 mA, 100 µs durat a impulso, 20 Hz) e prim a dell a ri mozi one dell e radici dorsal i , vari e regioni di quest ’ulti me vengono sottopost e ad INS clini ca (λ=2.12μm) ad energi e di es posi zi one radi ante variabili ; con opportune m odi fi che tecni che, il l as er viene port ato ad un out put con un’energia di esposizione radiante che va da 0 a 2.5 J/cm2 e con frequenze a 2 Hz.
I ri sult ati EMG mettono i n luce che INS manti ene i s uoi tipici vantaggi anche su quest i t essuti nervosi : ES (Figura 31 .A) attiva moltepli ci gruppi m uscolari ed anche alcuni dei cont rol at eral i, a
61 L'intervento normalmente prevede l'esecuzione di una laminectomia della colonna lombare, l'apertura della
dura sovrastante delle radici del nervo spinale lombare e l'identificazione fisiologica delle radici del nervo spinale dorsale coinvolte nel riflesso spastico mediante tecniche di stimolazione elettrica standard.
~ 83 ~ front e di singole s cari che ed allo stesso t em po si pres ent ano art efatti che oscurano i s egnali fisiologi ci ril evati durant e la regist razi one EM G; ment re INS (Figura 31.B), non solo attiva pochi gruppi muscol ari , support ando la grande precisione spazi al e di cui è tipica, ma le ris post e nervose ad essa derivata s ono ben distinguibili e bloccat e all a frequenza impost ata (2 Hz) .
Dopodi chè, una volt a asportat e, l e radi ci dors ali vengono sot topos ti ad es ami istol ogi ci al fine di osservare danni arrecati da INS in funzione dell’esposizione radiante: con energie < 1.09 J/cm2 non sono
stati individuati danni dovuti dall’ablazione termica, mentre la soglia di stim ol azi one può ess ere impost a a 0.50 -0.53 J/ cm2. Questi valori
defini scono il ti pico rapporto t ra la sogli a di sti mol azione e l a sogli a dei danni oss ervat i anche in al tri anim ali [138] a 2: 1. Nonos tante gli ottimi ris ult ati di quest o studi o [154], si pensa si ano, com unque, necess ari ult eriori st udi, perché i t es suti umani d ello studio preso i n es am e sono i n uno stat o di c ondi zi one pat ologi ca ; i ri sult ati INS potrebbero ess ere di fferenti su tessuti um ani sani .
Altri s tudi che hanno accresciuto l ’int eress e verso INS sono quelli condotti sul cuore: i primi studi di J enkins [155] [156] fatti su animal i muri ni i n vi vo avevano, infatti, di mostrat o che le cellul e miocardi ache sono a tutti gli effet ti s ensi bili al la radiazione infraross a.
Impulsi a λ = 1851 e 1.875 µm possono innes care l’i ni zio di un ci cl o cardiaco ed anche regolare l e frequenze cardiache al le st ess e frequenze degli impulsi l as er, alt erando così l e soll ecitazi oni e l a segnal azione m eccanicament e trasdott a, senza che vi siano danni all e cellul e es post e.
Figura 31
NeuroPhotonics - Infrared neural stimulation of human spinal nerve roots in vivo
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A prova di ciò, sono i com pl essi QRS della regi strazione EC G che seguono accurat amente gli im pulsi laser (Figura 32 ) appl icati su vari parti dell’atrio destro o sinistro di diversi cuori ex vivo di coniglio adulto [156]. Va s pecificato che s i osservano li ev i differenze nella sogli a di stimol azione t ra i di versi atri , dovut e, con alt a probabilit à , all a st rut tura anatom ica indivi dual e di ci ascun cuore .
Era, però, gi à not o dagli anni ’70 che l a stimol azione otti ca, sia con lunghezze d’onda del visibile e del l’ultravioletto, fosse capace di influenzare l’eccitabilità delle cellule miocardiache [7] [157]; tuttavi a, s ono st ati sempre riport ati danni a t ali cellul e perché l a luce a lunghezze d’onda inferiori a quelle dell’infrarosso produceva speci e ossigeno reattive (R OS), perci ò tale tecnica fu subit o abbandonat a. I meccanis mi per i quali si innescano battiti cardiaci a front e di impulsi IR non sono del tutt o noti e sono state avanzate divers i ipot esi. J enkins e coll eghi , rit engono che il m eccanis mo respons abil e dell a generazi one di APs e, di cons eguenza, dell e contrazioni m eccani che, si a lo st esso dedotto da Well s e colleghi, ovvero il gradient e t erm ico [109] [155].
Al contrario , autori di un alt ro st udi o [158] rit engono che il meccani smo principale si a costituito dal le rispost e dei segnali di Ca2 + mitocondri ali , le quali regol ano i m et aboli smi os sidativi dei mitocondri , perché hanno ri scont rato che ess e, a fronte di impulsi IR , sono si mili a quell e oss ervat e in altri st udi [127] [128] [129]; tuttavi a, è di ffi coltos o est rapolare ri sult ati diretti dai m itocondri dat a la nat ura alt am ent e dinami ca dei cardi omi ociti .
Per quant o riguarda l a s ogli a di st imol azi one, i valori s ono pi uttost o differenti a s econda che si t ratti di nervi afferenti/ efferenti e di neuroni corticali: non solo l a durat a mini ma di un impulso affinchè si generi no AP s nell e cell ul e miocardiache vari a da 2.5 ms a 12 ms, ma l’energia di esposizione radiante ha un range di 6 -11.8 J/cm2
Figura 32
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[156] , valori ben superiori ri spetto a tut ti quelli ri scont rati i n alt ri studi del INS che non hanno coinvolto quest e cel lul e. Tutt avi a, sono stati os servati danni delle paret i cellul ari con es posi zi one radiante pari o superiore a 7.9 J/ cm2. Dall’altra parte, però, rimane la caratt eristi ca ti pica del INS , ovvero che a ll ’aument are dell e frequenze degli impulsi, l a sogl ia di stimolazione diminuis ce.
I ri sult ati ot tenuti dall a sti mol azione ottica s ul cuore sono st ati val utat i t ra i più promett enti nel campo dell a biol ogi a e m edici na rigenerati va; la s ti molazione otti ca cons enti rebbe, i nfatt i, di sviluppare nuove m etodologie per l a comprens ione, fi n dall a fase embi onal e, di quegli st es si fenomeni nat urali delle at tivazioni el ettriche e m eccanotrasduttori, rit enuti difficil i da studiare. Infatti, la stimol azione el ett rica di un cuore embrional e è invasiva e spesso non port a a risult ati senza che s i presenti no danni ai suoi t ess uti.
INS nella coclea
La ragi one per cui s ono diffus i gl i st udi sulla stim ol azi one dei SGNs, oltre per int eressi cl inici , risi ede propri o nell a s truttura st es s a del la coclea, nella quale i neuroni sono confinati all’interno di uno spazio ben definit o e sono organi zzat i i n m odo che rende m ol to semplice l a loro stim ol azi one t ramite IR .
I neuroni del S GNs che si trovano alla bas e del la coclea percepiscono i toni ad alte frequenze, i suoni acuti, mentre quelli posti all’apice, i toni a bass e frequenze, i suoni gravi; tal e dist ribuzione è dett o tonot opi cit à.
INS, olt re che dal s ottile strat o in cui ris iedono i neuroni udi tivi, è favorit a anche dal d ens o st rato oss eo che t rat tiene gran part e dell a radi azi one infraross a non assorbita : ciò evit a che l a s timol azione arrivi a neuroni o ad alt re cell ul e post e al dilà di questi st rati ossei . Per la st ess a ragione, anche l a stimol azione elet tri ca attut at a s ugli stessi neuroni suscit ò grande otti mismo in pass ato: non a caso, gli impianti cocl eari elettri ci sono i dispositi vi bi oni ci che hanno avut o più successo tra t utt i quei di spositivi in grado di st imol are neuroni el ettricam ent e, cons ent endo ad olt re 600'000 pazienti di recuperare l’udito [159] [123] [9].
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Nonost ant e ci ò, numeros e sono controversi e, nell a letterat ura sci enti fi ca, relat ive ai m eccanismi pri ncipali d i INS appli cata all a cocl ea: ci sono s tudi che s ost engono che l ’at tivazione dei neuroni si a dirett am ent e correlata agli impulsi IR [123] [134] [160] , quindi un’attivazione mediante elevato gradiente termico sui neuroni, ed altri in base ai quali l’origine delle attivazioni sarebbe dovuta ad effetti fotoacusti ci o fotomeccani ci [18] [160] [19].
Tali effetti avvengono quando un piccol o volum e all o st at o liquido viene rapidam ent e surri scal dat o dagli impulsi laser IR creando dell e onde di pres sione che, di cons eguenza, colpis cono meccani cament e le cellule cili ate , l e quali, att ivandosi, ri las ci ano neurot rasm ettitori che andranno a stim olare i neuroni sottostanti, i nnes cando così un AP. Tutt avi a, è st at o oss ervato che INS evoca rispost e nervose, in parti col are CAP s , sol o in anim ali con un udito tot al e o resi duo [135] , ment re i n anim ali a cui sono stat i s ommi nistrat i alt e concent razioni di s ost anze otot ossi che62 si ott engono risul tati cont rast anti: ci sono
studi in cui sono stati ril evati ri spost e C APs a front e di im pulsi IR , com e gli s tudi i niziali di Izzo [161] ed al tri in cui non ne sono s tat i ris contrati [135] [162].
Dat a l a dis cordan za di tali risult ati , sono necess ari ulteriori studi: probabilm ent e l e sos tanze oto t ossi che, ut ilizzate i n m odelli animal i per ri produrre l a s i tuazione di ipoacus ia, pot rebbero al terare l a funzionalit à dell e cellul e cili at e i n modo da im pedi re ai neuroni uditivi di evocare un AP per i nsuffici enza di energi a ottica .
Se, i nvece , com e s uggeri sce Thompson [163], l e cell ule cili at e pres ent ass ero l e m ut azioni che determi na no l a sordità ai mam miferi e foss ero, comunque, eccit abili all ’espos i zione infrarossa i nnescando rispost e nervos e , si potrebbe chi ari re megli o il m eccanis mo e d ipoti zzare l o s viluppo di un nuovo tipo di impi anto cocl ear e che si bas erebbe s ull a st im olazione di quest e cellule, anzi ché dei neuroni. Un’altra caratteristica peculiare del INS applicata nella coclea riguarda i val ori soglia della stimolazi one IR : questi val ori sono considerevolm ent e i nferi ori se comparat i a quel li corrispondenti ai
62 Le sostanze ototossiche maggiormente utilizzate sono la neomicina, kanamicina ed acido etacrinico: queste
vengono impiegate per portare alla morte o disfunzione delle cellule ciliate, in modo da rappresentare una situazione di totale o parziale sordità.
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modelli periferici o corti cal i [122]; infat ti, vari m odelli m at emati ci riport ano che è suffi ci ent e un cambiam ento di t emperatura del 0.1° C , a vol te perfino 0.01°C, affinchè si i nnes chi un AP nei SGNs , contrariam ente all a vari azi one di 1-10°C ri ferito dai model li INS applicati ai neuroni periferi ci e corti cali [163] .
A conferm are questi modelli, s ono l e s ogl ie di s timol azione es press e in energi a radi ant e che s ono anch’essi not evolment e inferiori rispetto a quell e dei neuroni periferi ci o dei t essuti corti cali: si indivi duano singole ris post e nervose nel colli colo inferiore63 (ICC ) c on im pulsi di energia radiante media di 4.1 ± 1.9 μJ/pulse e con esposizione radi ant e m edi a di 10.3 ± 4.9; mentre per rispost e C APs , l’energi a radiante media è di 7.2 ± 4.7 μJ/pulse e l’esposizione radiante media è di 18.9 ± 12.2 mJ/ cm2 [18].
Quest a tipologi a di s tudio fu intrapres a per l a prim a volta da Izzo e coll eghi [134] [123], nel cui s tudi o si sti molavano i neuroni uditivi del gerbill o con impulsi IR (∼1.94 μm) di durata 5 μs e frequenza 2 Hz; sono stat i osservati ri sposte CAP s sia i n anim ali sordi64 che di controllo (non sordi ) , dim ost rando l’efficacia del INS .
La precisione s pazi ale tipi ca del INS fu verificat a successivament e , tramit e diverse m et odologi e, quali t ecniche di col orazione con fluores cenza [164], recording del (ICC ) [165] e ricost ruzioni µCT dell a cocl ea [166] .
Gli studi pi oneristi ci di Izzo e coll eghi [134] [123] suggeri sc ono che, per una stim ol azi one st abile (λ =1.844 e 1.873, f= 2 Hz) , l a durata degli impulsi non d ovrebbe superare i 30 μs, perché impul si con durat e m aggiori richi edono un’energi a radiant e m aggiore per avere le stesse ri sposte neurali.
Inol tre, poiché l e frequenze di processam ento dell e informazioni uditive da parte dei SGNs poss ono arri vare fino a 1 kHz, impulsi IR con durat e s uperi ori a 30 μs ridurrebbero cons eguentem ente i tem pi necess ari per il ril as sam ent o t erm ico, i ncrem entando così i l rischio di provocare danni t ermi ci ai t essuti .
63 ICC si trova nel tronco encefalico ed ha il ruolo di ri-processamento informazioni provenienti dalla coclea
per poi inviarli al talamo ed alla corteccia.