CAPITOLO 5: NOROVIRUS E SAPOVIRUS: EPIDEMIOLOGIA
5.1 IDENTIFICAZIONE DI CEPPI DI SAPOVIRUS E NOROVIRUS IN SUINI ASINTOMATICI IN ALLEVAMENT
ROMAGNA.
5.1.2 INTRODUZIONE
Norovirus e Sapovirus hanno un genoma ad RNA monocatenario e, sebbene l’organizzazione genomica vari tra i due generi, in entrambi il genoma codifica per un repertorio simile di proteine non strutturali (inclusa la RNA polimerasi RNA dipendente), per una proteina capsidica principale e per una proteina le cui funzioni restano sconosciute. I NoV e SaV sono la seconda causa di ricovero ospedaliero per gastroenterite (AGE) pediatrica e i NoV da soli sono responsabili di oltre il 50% delle epidemie di AGE nell’adulto. NoV e SaV infettano anche animali domestici e da reddito, e in particolare i suini e i bovini sono potenziali serbatoi di infezione per l’uomo.
Durante il primo semestre del 2006 e del 2008, 201 campioni fecali sono stati prelevati da suini clinicamente sani provenienti da 10 allevamenti. I campioni fecali sono stati analizzati per
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Norovirus e Sapovirus mediante un saggio di trascrizione inversa e PCR utilizzando la coppia di primer p289-p290 (Jang et al., 1999), amplificando una regione conservata all’interno dell’RNA polimerasi RNA dipendente (RdRP). Il metodo permette di individuare sia ceppi di Sapovirus (PEC) che di Norovirus suino.
5.1.2 MATERIALI E METODI
Campioni. Durante il primo semestre del 2006 e del 2008, 201 campioni fecali sono stati prelevati
da altrettanti suini clinicamente sani provenienti da 10 allevamenti, di cui 5 localizzati nella regione Emilia-Romagna e 5 nella regione Sicilia.
Estrazione dell’RNA e RT-PCR. L’RNA genomico totale è stato estratto da sospensioni fecali al
10% (in acqua) mediante il kit Qiamp-Viral RNA (Qiagen). L’RNA ottenuto è stato retrotrascritto (RT) e amplificato mediante il kit Superscript III One Tube (Invitrogen), utilizzando la coppia di primer p289-290, che appaiano in una regione della RdRp conservata nei Calicivirus, e amplificano un frammento di 319 bp per NoV e di 331bp per i Sapovirus.
Primers:
- Forward: p290 5'-GATTACTCCAAGTGGGACTCCAC-3' (Jiang et al., 1999) - Reverse: p289 5'-TGACAATGTAATCATCACCATA-3' (Jiang et al., 1999)
Analisi di sequenza. Gli amplificati ottenuti sono stati sequenziati utilizzando ABI PRISM BigDye
Terminator kit version 2.0 (Applied Biosystems); le sequenze ottenute sono state analizzate con il software DNASIS Max 2.0 (Hitachi) e il dendrogramma è stato costruito con il software Bionumerics (Applied Maths, Kortrijk, Belgium) con il metodo UPGMA.
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Dall’analisi dei campioni condotta mediante RT-PCR, 14 di 201 suini sono risultati positivi per la presenza di RNA virale (Tab. 5.1). Nel complesso, 5 allevamenti sono risultati positivi con una prevalenza che variava dal 2,7% al 25%. La differente numerosità campionaria degli allevamenti non ha permesso di stabilire una prevalenza media statisticamente significativa. Confrontando le prevalenze tra le varie classe di età solo animali di età compresa tra i 3-4 mesi e animali adulti con età uguale o superiore a 1 anno sono risultati positivi per Sapovirus all’analisi per RT-PCR. In particolare, come confermato dall’analisi di sequenza, un solo campione di età compresa tra i 3 ei 4 mesi è risultato positivo per la presenza di RNA genomico corrispondente a un ceppo suino di Norovirus.
Tabella 5.1 Prevalenza di sapovirus e norovirus in campioni di feci raccolti da suini asintomatici tra
il 2006 e il 2008.
L’analisi di sequenza (vedi materiali e metodi 5.1.2) dei campioni positivi ottenuti (indicati nei dendrogrammi di fig.5.1 in grassetto con asterisco) ha evidenziato un’ampia variabilità di genogruppi di sapovirus circolanti negli allevamenti esaminati. Tre ceppi di sapovirus identificati appartenevano al genogruppo GVIII, mentre i restanti tre ceppi, SwSaV34_2IT, swSaV36_6IT e swSaV17_5IT mostravano un’identità nucleotidica del 57,8% con ceppi di sapovirus suino descritti in Canada, a cui non è stato ancora attribuito un genogruppo definitivo. Nessun ceppo apparteneva al genogruppo prototipo suino, GIII, generalmente più comune.
E’ stato identificato un solo campione di norovirus, denominato swNoV40_1IT, il quale dall’analisi di sequenza è risultato appartenere al GII.11, genotipo identificato solo in campioni suini.
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Figura 5.1 Analisi filogenetica di sapovirus e norovirus suini, messi in evidenza nel corso dello
studio, sulla base di 289 nt nella regione della RNA-dependent RNA polymerase. Il dendrogramma è costruito con il metodo UPGMA.
5.1.4 DISCUSSIONE
Gli RNA provenienti da 13 campioni fecali suini sono risultati positivi al test di RT-PCR, mostrando una banda di DNA delle dimensioni attese (≈319bp per norovirus e 331bp per PEC). Per confermare i risultati ottenuti e caratterizzare i ceppi coinvolti, sei campioni positivi sono stati sequenziati. L’analisi delle sequenze ottenute ha confermato che cinque ceppi appartenevano al genere Sapovirus, mostrando un’identità di sequenza nucleotidica tra il 79% e l’85% con altri ceppi suini descritti in Europa. Uno dei ceppi sequenziati è invece risultato appartenere al genere Norovirus, in particolare al tipo GII.11, che è un genotipo comune sinora riscontrato tra i soli ceppi
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suini, sebbene appartenga allo stesso genogruppo (GII) dei ceppi umani di norovirus. Lo studio condotto, se pur preliminare, ha mostrato una prevalenza del 13% (tra NoV e SaV) in suini sani, indicando che questi virus stanno circolando in maniera endemica negli allevamenti suini italiani. L’assenza di sintomatologia in questi soggetti potrebbe essere correlata ad parziale immunità protettiva acquisita da precedenti contatti con il virus. Nel suino sembra più comune la presenza di sapovirus, in particolare in animali di pochi mesi di età, come già evidenziato in altri lavori (Barry et al., 2008; Jeong et al., 2007; Martinez et al., 2006; Wang et al., 2006). L’analisi di sequenza ha dimostrato che i ceppi di PEC e NoV individuati sono correlati e vicini geneticamente ai ceppi umani. Infatti, il genogruppo GVIII occupa una speciale posizione tra i sapovirus, essendo generalmente correlato ai sapovirus umani (specialmente quelli del genogruppo GV e GI) piuttosto che ad altri genogruppi (Martella et al., 2008; Wang et al., 2005). Il genogruppo GVIII potrebbe essere un crossing-point tra i sapovirus umano e suino, come mostrato dall’analisi delle sequenze. Quindi sebbene non dimostrata, la possibile origine zoonotica non può essere esclusa. Ulteriori studi condotti sono necessari per meglio caratterizzare filogeneticamente i ceppi identificati. Considerando i risultati di questo studio, la presenza di norovirus e sapovirus in allevamenti di suini lascia ipotizzare che questa specie possa rappresentare un potenziale serbatoio di questi virus. Anche se la malattia clinica associata a NoV e SaV nei suini è poco conosciuta, appare comunque opportuno caratterizzare questi agenti, possibilmente patogeni per l’uomo, in quanto presenti in animali destinati all’alimentazione umana. In particolare, la conoscenza del loro potenziale di diffusione e del loro contributo a eventi di ricombinazione è importante per avere una maggiore informazione sul ruolo del suino come potenziale serbatoio di sapovirus e norovirus a trasmissione zoonosica.
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CAPITOLO 6: Norovirus bovino (BEC): possibile
agente di zoonosi?
La stretta relazione genetica tra i norovirus che infettano gli animali e quelli che infettano l'uomo ha sollevato la questione sul potenziale zoonotico di questi virus che, se fosse dimostrato con certezza, avrebbe conseguenze di vasta portata per l'epidemiologia e la sicurezza alimentare. L’ipotesi della trasmissione zoonotica è avvalorata anche dall’identificazione nell’uomo di anticorpi diretti contro norovirus animale e viceversa, ovvero identificazione di anticorpi diretti contro norovirus umani nel suino (Farkas et al., 2005). I primi ceppi animali di norovirus vennero scoperti nel bovino (Scipioni et al., 2008), e venne anche osservata una sieroprevalenza più elevata nei veterinari professionalmente esposti (Widdowson et al., 2005). Tuttavia, negli anni la possibilità di trasmissione zoonotica dal bovino all'uomo è in gran parte svanita, non essendo mai stata riportata l'identificazione di ceppi bovini nell'uomo (Oliver et al., 2003). Sebbene non si possa escludere che l'animale possa funzionare da serbatoio per l'insorgenza di nuove varianti virali, le distanze genetiche (Oliver et al., 2003) e le differenze tra i recettori (Farkas et al., 2005; Hutson et al., 2003) osservate nei ceppi umani e animali non supportano l’ipotesi di permissività dell’uomo ai ceppi bovini. La recente identificazione di sequenze simili a GII.4 di NoV umano nei suini e bovini in Canada potrebbe tuttavia modificare la valutazione del possibile rischio zoonotico (Mattison et al., 2007).
I ceppi di norovirus che infettano il bovino (BEC) vengono classificati tutti nel genogruppo III, distinto filogeneticamente dai genogruppi che includono i ceppi umani (Oliver et al., 2006). L'infezione da BEC è stata descritta in molti paesi (Mauroy et al., 2009; Yilmaz et al., 2010; Kaplon et al., 2011), in animali di diverse fasce di età (van der Poel et al., 2003); i soggetti giovani sembrano tuttavia essere i più colpiti e in genere mostrano diarrea e sintomi più severi rispetto a quelli osservabili negli animali adulti. L'infezione è stata anche descritta in animali totalmente asintomatici (van der Poel et al., 2000).
Nel presente capitolo sarà descritto uno studio relativo alla ricerca di BEC in bovini affetti da diarrea allevati nel Nord Italia. Nella seconda parte del capitolo, verrà riportato uno studio di sieroprevalenza di anticorpi anti-NoV in medici veterinari, realizzato utilizzando come antigene la proteina capsidica assemblata in VLP di ceppi di norovirus umano e bovino.
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