RICERCA DI ANTICORPI ANTI HEV IN SIERI UMANI UTILIZZANDO LA PROTEINA CAPSIDICA

DEL CEPPO ITALIANO SUINO g3

4.3.1 INTRODUZIONE

In molti paesi industrializzati, è segnalato un numero crescente di casi autoctoni di infezione da HEV, causati da ceppi virali appartenenti al genotipo g3 (Buti et al., 2004; Dalton et al., 2008; Herremans et al., 2007; Ijaz et al. 2009; Mansuy et al., 2004; Péerez-Gracia et al., 2004; Preiss et al., 2006), largamente circolanti in Europa anche negli animali (suini, cinghiali e cervi). I ceppi di HEV g3 rilevati nei casi umani di epatite E e nei suini della stessa area geografica sono spesso risultati strettamente correlati geneticamente (van der Poel et al., 2001; Meng et al., 2003; Péerez- Gracia et al., 2004; ). La possibilità di trasmissione zoonosica dell’HEV dal suino all’uomo è confermata dalle descrizioni di casi di epatite acuta in soggetti che avevano consumato carne cruda di cervo, fegati di suino, o fegati di cinghiale (Matsuda et al., 2003; Tei et al., 2003), ed è significativo a tal fine il recente ritrovamento di RNA genomico di HEV e virus infettivi in fegati in commercio in USA, Olanda e Giappone (Bouwknegt et al., 2007; Feagins et al., 2007).

La mancanza di un sistema di coltura cellulare per la replicazione del virus in vitro ha ostacolato l’uso di antigeni virali naturali per la diagnosi sierologica, quindi, differenti peptidi sintetici e polipeptidi ricombinanti sono stati esaminati per la messa a punto di sistemi diagnostici in grado di evidenziare gli anticorpi specifici anti HEV, sia nell’uomo sia negli animali (Emerson et al., 2003; Pintò et al., 2007). Attualmente, sono disponibili kit commerciali disegnati per la diagnosi sierologica in sieri e plasma umani, che utilizzano come antigene corti frammenti delle proteine ricombinanti ORF2 e ORF3 di ceppi di HEV appartenenti al g1 e g2, ma non al g3, genotipo comune nei suini e nell’uomo nei paesi industrializzati (Meng et al., 2003; Pintò et al., 2007). Vari lavori suggeriscono che i test commerciali non sono ottimizzati per la ricerca di anticorpi nei sieri di pazienti con infezione da HEV g3 (Daniel et al., 2004; Herremans et al., 2007).

Lo scopo di questo lavoro è stato l’utilizzo della proteina ricombinante di un ceppo suino g3 italiano (capitolo 3, e paragrafo 4.2 in questo capitolo) per la ricerca di anticorpi anti-HEV in sieri umani.

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4.3.2 MATERIALI E METODI

Campioni. I sieri umani in esame derivano da uno studio condotto presso l’Istituto Nazionale per le

Malattie Infettive “Lazzaro Spallanzani” di Roma, provenienti relativo a soggetti affetti da epatite acuta non A, non B, non C, precedentemente esaminati per la ricerca di anticorpi anti-HEV con test ELISA commerciale (La Rosa et al., 2011). Sono stati utilizzati 12 sieri umani positivi al test ELISA commerciale per HEV. Un ulteriore siero (n° 13) aveva fornito esito negativo ai test per la diagnosi di tutte le forme di epatite.

GENOTIPI HEV g1 g3

SIERI UMANI positivi _{n°1; n°8; n°9; n°10;}

n°11; n°12

n°2; n°3; n°4; n°5; n°6; n°7;

Tabella 4.7 Campioni sieri umani.

Produzione e purificazione dell’antigene. Sono state utilizzate le stesse metodiche descritte nel

capitolo 3 di questa tesi (materiali e metodi 3.1.2).

Western blotting. E’ stata utilizzata la stessa metodica descritta nel paragrafo 4.2.2 di questa tesi. I

sieri umani sono stati utilizzati alla diluizione di 1:100 in PBS con 1% di latte, e in ultimo la membrana è stata incubata con una diluizione 1:3000 di anticorpo anti-IgG (H+L) umane, coniugato con fosfatasi alcalina (SIGMA).

ELISA-ORF2 per la ricerca di anticorpi (IgG) anti-HEV in sieri umani. E’ stata utilizzata la

stessa metodica descritta nel paragrafo 4.2.2 di questa tesi. I sieri sono stati esaminati in triplicato, alle diluizioni di 1:50; 1:100; 1:200; 1:400 in PBS con 2,5% latte; successivamente la piastra è stata incubata con l’anticorpo anti-IgG (H+L) umane, coniugato con fosfatasi alcalina (SIGMA), alla diluizione di 1:3000 in PBS con 2,5% di latte.

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4.3.3 RISULTATI

Western blotting

Undici sieri umani dei 12 esaminati (fig. 4.6) hanno riconosciuto in maniera specifica la stessa proteina delle dimensioni attese (55kDa), confermando la presenza di anticorpi anti HEV diretti contro la proteina capsidica e i risultati del test ELISA commerciale. Queste osservazioni confermano la presenza di epitopi comuni tra la proteina capsidica di HEV suino g3 espressa in baculovirus ricombinante e quelle di HEV g1 e g2 umani, presenti nel test commerciale.

Figura 4.6. Analisi di 12 sieri umani, esaminati contro la proteina ricombinante ORF2 di un ceppo

suino g3, mediante Western blotting. La freccia indica le bande corrispondenti alla proteina ricombinante. Linee 1-12 sieri umani, siero 13 controllo negativo linea 14 controllo positivo (siero policlonale suino anti-HEV), MW= marker.

ELISA-ORF2. Undici dei 12 sieri esaminati sono risultati positivi anche al test ELISA basato

sull’antigene del ceppo HEV g3 di suino; peraltro i valori di OD ottenuti confermavano i risultati del Western blotting. Il segnale più marcato nel WB corrispondeva ad un valore di assorbanza più alto. Il siero umano risultato negativo in WB si è confermato tale anche nel test ELISA-ORF2.

4.3.4 DISCUSSIONE

La proteina capsidica del ceppo suino di HEV g3 è stata riconosciuta in maniera specifica dai sieri umani precedentemente risultati positivi ad un test ELISA commerciale che impiega antigeni di

MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 K-- pos pos

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HEV di genotipo 1 e 2. I sieri in esame erano anche risultati positivi alla ricerca di RNA di HEV g3 o g1, come riportato in Tabella 4.5 (La Rosa et al., 2010). Già studi precedenti (Mast et al.,1998; Meng et al., 1997) hanno dimostrato che la proteina ricombinante ORF2 g3, utilizzata come antigene in ELISA, riconosce efficientemente anticorpi anti-HEV in sieri umani, di scimpanzé e in suini.

L'antigene g3 ricombinante descritto in questo lavoro di tesi è stato riconosciuto in maniera specifica dai sieri di pazienti infettati con entrambi i genotipi g1 e g3, supportando ulteriormente l'esistenza di un unico sierotipo di HEV. Tuttavia, non si può escludere che la positività anticorpale riscontrata nei sieri dei pazienti possa originare da un’infezione pregressa con un genotipo di HEV diverso da quello identificato all’atto dell’arruolamento del paziente.

I risultati ottenuti con l’ELISA-ORF2 utilizzante la proteina ricombinante del ceppo di origine suina italiano dimostrano la validità del test sia in termini di sensibilità che di specificità. Confrontato con un test commerciale basato su antigeni di g1 e g2, il test messo a punto in questo lavoro test risulta essere un test sensibile e idoneo per la ricerca di anticorpi sia in sieri di suino che in sieri umani, specialmente quando si ipotizzi il coinvolgimento di HEV g3. I dati qui riportati confermano che l’antigene g3 reagisce con livelli simili di sensibilità sia con anticorpi stesso verso il genotipo g3 nei suini sia con anticorpi verso i genotipi g1 e g3 nell’uomo. Conseguentemente, il test ELISA-ORF2 potrebbe essere utile per investigare anticorpi contro virus di diversi genotipi, sia per il basso costo che per la facilità di utilizzo. In un lavoro condotto da Engle e colleghi, nel quale sono stati usati un antigene di origine umana (Sar-55) e uno suino (ceppo suino identificato da Meng) mediante test ELISA, gli autori hanno dimostrato che entrambi gli antigeni erano intercambiabili rispetto allo loro abilità di riconoscere gli anticorpi anti-HEV in sieri umani e di suino (Engle et al., 2002).

Tuttavia, il numero di sieri umani esaminati in questo lavoro è esiguo, e non consente di escludere una maggiore specificità di antigene e anticorpi omologhi per genotipo, e ulteriori analisi su un campione più ampio saranno necessarie.

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