RISULTATI

Identificazione di RNA genomico di HEV mediante RT-PCR

RNA di HEV è stato identificato in 31 dei 48 suini esaminati (64,4%), in almeno una delle matrici esaminate; i risultati sono stati ottenuti inizialmente con una nested RT-PCR amplificando un frammento di 145 nucleotidi dell’ORF2 (Erker et al., 1999).

I risultati dell’identificazione della presenza del genoma virale nelle feci, bile e fegato, in funzione dell’età degli animali sono riportati in tabella 4.3.

La bile risultava la matrice più frequentemente positiva per la presenza di RNA di HEV (23/45), seguita dalle feci (16/48) e dai fegati (10/48). L’RNA genomico di HEV è stato riscontrato in entrambi i gruppi di suini: 3-4 mesi d’età (19/29); 9-10 mesi di età (12/28). Nei suini giovani, la prevalenza di HEV nella bile o nelle feci era significativamente più alta che nei suini di età superiore ( =3.94, p=0.047; =15.47, p=0.001). Al contrario, la proporzione di fegati positivi per HEV nelle due classi di età non è risultata statisticamente differente (p>0.05).

La prevalenza osservata in suini di 3-4 mesi era significativamente più elevata ( =13.87; p=0.001), essendo infatti risultati positivi 19 di 20 animali esaminati (95%); in animali adulti (9-10 mesi), invece, la prevalenza era del 42,9% (12 positivi di 28 esaminati).

Inoltre, 17 animali sono risultati positivi per diverse matrici (tabella 4.4). In un solo suino, l’RNA di HEV è stato identificato in tutte e tre le matrici esaminate, mentre 9 suini sono risultati positivi nella bile e feci, 5 nella bile e fegato e 2 per fegato e feci.

Per ottenere frammenti di DNA più lunghi, 33 campioni (14 bili, 12 feci e 7 fegati), positivi in prima analisi, sono stati analizzati usando un secondo protocollo di nested-RT-PCR (Huang et al., 2002), che amplifica un frammento dell’ORF2 di 320 nucleotidi. In 18 dei 33 campioni, i positivi sono stati confermati con i due metodi di RT-nested-PCR.

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Tabella 4.3. Presenza di RNA di HEV in bile, feci e fegato da suini, per età

Numero di campioni esaminati/ HEV positivi (%)

Matrice Giovani

(3-4 mesi)

Adulti

(9-10 mesi) Totale

Bile, feci e fegato 0/20 (0,0) 1/28 (3,6) 1/48 (2,1)

Bile e feci 9/20 (45,0) 0/28 (0,0) 9/48 (18,8) Bile e fegato 2/20 (10,0) 3/28 (10,7) 5/48 (10,4) Feci e fegato 2/20 (10,0) 0/28 (0,0) 2/48 (4,2) Solo bile 2/20 (10,0) 6/28 (21,4) 8/48 (16,7) Solo feci 2/20 (10,0) 2/28 (7,1) 4/48 (8,3) Solo fegato 2/20 (10,0) 0/28 (0,0) 2/48 (4,2) Totale bili a 13/19 (68,4) 10/26 (38,5) 23/45 (51,1) Totale feci 13/20 (65,0) 3/28 (10,7) 16/48 (33,3) Totale fegato 6/20 (30,0) 4/28 (14,3) 10/48 (20,8)

Suini positivi in almeno un campione 19/20 (95,0) 12/28 (42,9) 31/48 (64,6)

Suini positivi in più campioni 1/20 (5,0) 16/28 (57,1) 17/48 (35,4)

a

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Tabella 4.4. Presenza di RNA di HEV in differenti campioni di suini sieropositivi e sieronegativi. Campioni positivi per RNA HEV in: No. di suini

Bile Fegato Feci

HEV Sieropositivi - - - (15) a + - - (7) + + - (3) + + + (1) + - + (8) - - + (3) - + + (1) - + - (2) Totale 19 7 13 (40) HEV Sieronegativi - - - (2) + - - (0) + + - (2) + + + (0) + - + (0) - - + (1) - + + (1) - + - (0) Totale 2 3 2 (6) TOTALE 21b 10 15 (46) c a

In parentesi é indicato il numero di suini positivi per RNA di HEV nella linea corrispondente.

b

In grassetto é indicato il numero dei campioni di campioni positivi per RNA di HEV, nel gruppo di animali.

c

Due dei 48 suini totali analizzati in questo studio non sono stati inclusi, perché i loro sieri non erano disponibili per l’analisi sierologica.

Sieroprevalenza di anticorpi anti-HEV in suini.

Quaranta di 46 sieri suini esaminati (87%) sono risultati positivi utilizzando un ELISA commerciale (paragrafo 4.2.2) adattato all’identificazione di anticorpi IgG di suino. Sieri policlonali suini sono stati utilizzati come controllo positivo e negativo. La sieroprevalenza è risultata più elevata nei suini di 9-10 mesi (25 positivi/27 totali; 96,6%), che in animali di 3-4 mesi, nei quali la siero prevalenza di anticorpi nei sieri era 78,9% (15/19); tale differenza non è tuttavia risultata statisticamente significativa (p>0.05). La proporzione di campioni RNA positivi di bile, feci e fegati non era significativamente diversa (p>0.05) tra suini sieronegativi e sieropositivi per Ig. Tuttavia,

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25 di 40 (62,5%) suini sieropositivi per Ig erano anche positivi per la presenza di genoma di HEV in bile, fegato e/o feci, mentre 15 (37,5%) erano negativi per la presenza di RNA virale in tutti i campioni (Tabella 4.4).

Due dei 6 (33,3%) animali sieronegativi erano negativi per la presenza di RNA virale in tutti i campioni, mentre i rimanenti 4 (66,7%) suini erano positivi per il genoma di HEV nella bile, fegato e/o feci (tabella 4.4).

Per due animali, i campioni di siero non sono stati raccolti.

Sequenziamento e analisi filogenetica

Sequenze del frammento diagnostico (320 nucleotidi) del gene della proteina capsidica di HEV sono stati ottenuti da 14 campioni (5 da bile, 5 da feci e 4 da fegato) e depositati in NBCI GenBank. Le sequenze di HEV sono state ottenute dal fegato e dalla bile prelevati da uno stesso animale, in un caso, e da bile e feci di altri tre suini. In questi casi, sono state ritrovate identità nucleotidiche del 100% tra sequenze di HEV ottenute dalle differenti matrici dello stesso suino. Dopo sequenziamento e analisi comparativa con i 4 genotipi conosciuti di HEV, tutte le sequenze sono risultate appartenere al genotipo g3, raggruppate nei subtipi c o f, in analogia a quanto riportato per HEV umano e suino in altre aree dell’Europa (Fig 4.2). I due cluster g3c e g3f mostravano tra loro identità nucleotidica del 79%. Gli otto ceppi di HEV che formano il cluster g3c presentavano tra loro un’identità nucleotidica del 98,9-100%.

Ulteriori sequenze sono state ottenute da 12 campioni di feci e 5 di fegato, usando un protocollo di nested RT-PCR che amplifica un frammento di 121 nucleotidi (Erker et al., 1999); anche questo gruppo di sequenze ha confermato che tutti i ceppi di suino appartenevano al genotipo g3 subtipi c e f. per Rispetto ad altri ceppi di HEV suino di subtipo f descritti in Italia precedentemente (Di Bartolo et al., 2008), quelli qui riportati mostravano un’identità nucleotidica dall’85% al 100%. I ceppi appartenenti al subtipo c mostravano invece un’identità nucleotidica dell’80,9% con un ceppo suino recentemente riportato in Italia da Di Martino et al. 2010.

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Figura 4.2 Dendrogramma, disegnato utilizzando il metodo UPGMA e un ceppo aviario di HEV

(Stati Uniti, Acc. No. AY535004), come outgroup. Il dendrogramma è basato sulla parziale sequenza del frammento ORF2. Il numero di accesso, l’origine e il genotipo sono stati riportati per tutti i ceppi, l’origine dei ceppi identificati in questo studio è stata riportata nel dendrogramma. I ceppi relativi al presente lavoro di tesi sono indicati con il simbolo ♦ in grassetto.