IDENTIFICAZIONE DELLE SPECIE E DEL SIEROTIPO

In questa fase dello studio è stato usato il kit legionella Latex Oxoid, che sfruttando il test di agglutinazione al lattice permette l’identificazione separata di Legionella pneumophila sierogruppo 1, dei sierogruppi da 2 a 14 nonchè l’individuazione di sette ulteriori specie di legionella. Legionella Latex Oxoid impiega particelle di lattice blu

sensibilizzate con anticorpi che agglutinano in presenza di antigeni specifici della parete cellulare di legionella, formando un precipitato evidente; è dunque un metodo di screening semplice e rapido per il riconoscimento dei sierotipi e delle specie patogene predominanti di legionella. La sensibilità del test è del 99% e la specificità è del 100%. Il materiale compreso nel kit è rappresentato da:

• DR801 Legionella pneumophila sierogruppo 1 reagent test che contiene particelle in lattice blu sensibilizzate con anticorpi specifici di coniglio che reagiscono con l’antigene di Legionella pneumophila sierogruppo 1;

• DR802 Legionella pneumophila sierogruppi 2-14 reagent test che contiene particelle in lattice blu sensibilizzate con anticorpi specifici di coniglio che reagiscono con l’antigene di Legionella pneumophila sierogruppi 2-14;

• DR803 Legionella species reagente test che contiene particelle in lattice blu sensibilizzate con anticorpi specifici di coniglio che reagiscono con le seguenti specie ed i seguenti sierotipi di legionella e cioè L. longbeachae 1e 2, L. bozemanii 1 e 2, L. dumoffii, L. gormanii, L. jordanis, L. micdadei, L. anisa.

• DR804 sospensione di controllo positivo composta da una sospensione polivalente di cellule di legionella in soluzione tamponata;

• DR805 sospensione di controllo negativo composta da una sospensione di cellule di L.spiritensis non reattive con i reagenti del test;

• DR806 lattice di controllo composto da particelle di lattice blu sensibilizzate con globuline di coniglio non reattive con i reagenti del test;

• DR807 Soluzione tampone costituita da soluzione salina tamponata (pH 7,3); • DR500 Cartoncini di reazione.

3.6.1 Procedimento

Una volta verificata la presenza di crescita sul terreno BCYE e l’assenza di crescita su terreno CYE e appurata l’appartenenza della colonia in esame al gruppo dei batteri Gram negativi, si è proceduto con l’identificazione della specie e del sierotipo.

Prima dell’esecuzione del test è opportuno controllare il corretto funzionamento del reagente al lattice utilizzando le sospensioni di controllo fornite nel kit. Verificato che i reagenti funzionano correttamente, si procede a testare direttamente le colonie:

1. distribuire 1 goccia di ciascun reagente al lattice (DR801, DR802, DR803, DR806) all’interno dei 4 cerchi predisposti sul cartoncino di reazione;

2. distribuire 1 goccia di soluzione tampone per diluizioni (DR807) all’interno di ciascuno dei 4 cerchi presenti sul cartoncino di reazione assicurandosi che in questa fase il lattice e il tampone non si mescolino;

3. usando un’ansa sterile, prelevare 1 colonia di almeno 1 mm di diametro (se le colonie sono più piccole prelevarne 2 o più) da terreno selettivo BCYE ed emulsionarla accuratamente con la soluzione tampone assicurandosi che la sospensione sia omogenea;

4. mescolare i reagenti al lattice con la sospensione, spandendo la miscela sull’intera area di reazione;

5. ruotare delicatamente il cartoncino di reazione ed osservare l’eventuale presenza di agglutinazione che dovrebbe pervenire entro 1 minuto.

L’agglutinazione di uno dei reagenti al lattice e l’assenza di agglutinazione con il reagente di controllo DR806 permettono di confermare la presenza di Legionella pneumophila sierogruppo 1, o sierogruppo 2-14, o Legionella spp. (Figura 3.8)

Le colonie che danno risultato positivo al reagente DR802 (sierogruppo 2-14) verranno testate per individuare a quale sierotipo specifico appartengono.

Fig. 3.8. Risultato positivo e negativo al test di agglutinazione

3.6.2 Sierotipizzazione

La sierotipizzazione permette di definire a quale sierogruppo appartengono le colonie di legionella risultate positive al test con particelle al lattice sensibilizzate con anticorpi specifici che reagiscono con gli antigeni di Legionella pneumophila 2-14 (DR802). I 13 reagenti di agglutinazione, ognuno specifico per un solo sierogruppo di Legionella pneumophila, consistono in una sospensione tamponata di particelle di lattice bianco rivestite con anticorpi purificati. Gli anticorpi sono specificamente indirizzati contro gli antigeni di superficie del sierogruppo Legionella pneumophila. Quando una goccia di una sospensione di colonie, sospette di appartenere al genere legionella, è miscelata

con una goccia di reagente al lattice e l’organismo in questione è uno dei sierogruppi 2- 14 di Legionella pneumophila, essa si legherà al lattice sensibilizzato specifico anti- legionella. La miscela determinerà un’agglutinazione e l’aggregato risultante sarà visibile ad occhio nudo.

3.6.3 Tipizzazione Legionella pneumophila sierogruppo 15 e identificazione

Legionelle spp.

L’identificazione della Legionella pneumophila sierogruppo 15 e delle Legionelle spp che sono state oggetto di studio (L. bozemanii, L. dumoffii, L. gormanii, L. micdadei), è stata ottenuta grazie all’utilizzo dello stesso procedimento ma con uso di reattivi diversi (Denka Seiken Co.).

Il reattivo specifico per L. bozemanii, L. dumoffii, L. gormanii, L. micdadei e Legionella pneumophila sierogruppo 15 è costituito da anticorpi di coniglio specifici per ogni specie sopra citate. Il procedimento è identico sia per l’identificazione di Legionella pneumophila sierogruppo 15 sia per la speciazione di Legionella spp:

1. Sospendere un quantitativo sufficiente all’esecuzione del test di crescita batterica in 3 ml di soluzione fisiologica e bollire le colonie da testare a 100°C per 1 ora.

2. Centrifugare la soluzione scaldata a 900 giri per 20 minuti, scartare il sovranatante e risospendere il precipitato con 0,5 ml di soluzione fisiologica (sospensione antigenica). 3. Mettere in un vetrino pulito una goccia di antisiero (5-10 µl) in una goccia di sospensione antigenica;

4. Mescolare i reagenti agitando il vetrino per circa un minuto finchè non compare l’agglutinazione

Il test sarà considerato positivo se l’agglutinazione è ben visibile a occhio nudo entro un minuto. La conferma di reazione positiva deriva anche dalla non agglutinazione del controllo negativo (sospensione di antisiero e soluzione fisiologica).

Se nessuno dei 4 antisieri dà esito positivo, i ceppi isolati verranno classificati come Legionelle spp. in quanto si è in presenza di altre specie di Legionelle non rilevabili con i kit attualmente in commercio.