Isolamento virale

È considerato il gold standard tra tutte le metodiche di diagnosi virologica. La corretta esecuzione trasporto e conservazione del prelievo da parte del personale clinico e di laboratorio è un presupposto fondamentale per garantire l'efficacia e la validità del metodo. I virus, infatti, essendo parassiti endocellulari obbligati, necessitano di sistemi cellulari vitali per potersi replicare ed esplicare le proprie funzioni. Il metodo colturale è l'unico che consente di isolare e propagare il virus permettendone la caratterizzazione e l’eventuale conservazione per numerosi studi. Inoltre consente di isolare e caratterizzare virus clinicamente non sospettati o non ancora conosciuti (coronavirus, SARS) in quanto su una coltura possono crescere diversi agenti virali (tutti quelli verso cui la linea cellulare è permissiva). Nella tabella 5A sono riportate le più comuni linee cellulari e le relative sensibilità ad alcuni dei più comuni virus.

PMK Hep-2 A549 Vero BGM ML CV-1 HL MRC5

ADV + + + + CMV + + HSV + + + + + + INFV + + + HPIV + + RSV + + + + + Rotavirus + + + VZV + + +

L'isolamento virale tradizionale richiede tempi lunghi per arrivare ad una diagnosi, devono essere disponibili del personale esperto, aree di laboratorio dedicate e linee cellulari permissive a diversi virus. La metodica prevede un opportuno pre-trattamento del campione con un’adeguata quantità di terreno contenente un antibiotico ed antimicotico (generalmente VIB), per evitare contaminazioni batteriche e fungine. Il campione deve essere poi seminato su linee cellulari selezionate ed incubato a 37°C al 5% di CO2 per un periodo di tempo variabile, monitorando giornalmente, al microscopio a

luce invertita, per la ricerca dell'eventuale effetto citopatico. Si procede poi all'identificazione virale, utilizzando prevalentemente metodiche immunologiche (immunofluorescenza o immunoperossidasi) per la ricerca degli antigeni virali in coltura. [89]

Una particolare metodica colturale è rappresentata dall'isolamento rapido su Shell-Vial, che prevede l'inoculo del virus mediante centrifugazione su un monostrato cellulare fatto propagare sopra un vetrino copri oggetto circolare deposto sul fondo di una provetta o di una piastra. La crescita virale col metodo rapido viene valutata mediante la ricerca di proteine precoci virali già dopo 18-48 ore dall'inoculo, senza attendere la comparsa dell'effetto citopatico. Questo metodo consente, rispetto all'isolamento tradizionale, di ridurre enormemente i tempi d’isolamento dei virus a crescita lenta. Inoltre, la fase di centrifugazione facilita l'ingresso del virus nelle cellule aumentando notevolmente la sensibilità dell'isolamento [79]. Ciò ha trovato particolare applicazione nella diagnosi di CMV.

5.2.3 Ricerca degli antigeni virali

E’ un metodo rapido e pratico di diagnosi, ma che richiede un’adeguata presenza di antigene virale nel campione. Oggi sono disponibili un gran numero di anticorpi monoclonali, che garantiscono livelli adeguati di sensibilità e specificità. Le tecniche utilizzate per la rivelazione degli antigeni sono:

immunofluorescenza diretta o indiretta (IF) ed immunoperossidasi (IP), che tendono però ad essere

inficiate da variabili legate al campione e alla soggettività dell’operatore e saggi immunoenzimatici in fase solida (EIA ed ELISA), che risultano meno dipendenti dalle variabili precedentemente elencate e più adatte all'automazione.

Immunofluorescenza ed immunoperossidasi

L’immunofluorescenza viene utilizzata per cercare e identificare, in un prelievo umorale o tissutale, anticorpi sierici diretti contro un agente patogeno (immunofluorescenza indiretta) oppure i suoi antigeni caratteristici (immunofluorescenza diretta). I marcatori impiegati in questo tipo di analisi sono fluorocromi, sostanze che, se colpite da una luce incidente ad una particolare lunghezza d’onda, hanno la capacità di emettere luce ad una lunghezza d’onda maggiore. I più utilizzati sono l’isotiocianato di fluoresceina (FITC) e l’isotiocianato di tetrametilrodamina (TRITC).

Nell’immunofluorescenza diretta, il fluorocromo è direttamente legato all’anticorpo che si lega all’antigene virale che si vuole identificare. Nell’immunofluorescenza indiretta, esso è invece legato ad un anticorpo anti-Ig. La visualizzazione della marcatura avviene tramite microscopio a fluorescenza, il quale non è altro che un normale microscopio a trasmissione con l’aggiunta di filtri per selezionare le opportune lunghezze d’onda.

L’immunoperossidasi, invece, è un tipo di colorazione utilizzato in clinica diagnostica che si basa sulla visualizzazione di anticorpi tramite una reazione colorimetrica catalizzata dalla perossidasi.

Enziyme Linked Immuno Sorbent Assay

Un’altra tecnica molto utilizzata per la ricerca degli antigeni virali è l’Enziyme Linked Immuno

Sorbent Assay, meglio conosciuto sotto l’acronimo di ELISA. Utilizza un marcatore enzimatico,

come la β-galattosidasi, la fosfatasi alcalina (AP) o la perossidasi HRP. Il test si basa sul fatto che un enzima coniugato ad un anticorpo reagisce con un substrato incolore, detto substrato cromatogenico, e dà origine ad un prodotto di reazione colorato. L’intensità del colore è proporzionale alla quantità d’anticorpo marcato che si lega all’antigene.

In un ELISA, un antigene deve essere immobilizzato su una superficie solida. Questo viene quindi complessato con un anticorpo che è in genere associato a un enzima. La rivelazione è ottenuta incubando questo complesso enzimatico con un substrato che produce un prodotto rilevabile. L'elemento fondamentale della strategia di rilevazione è l'altissima specificità dell'interazione tra anticorpo e antigene. Il mercato propone un'ampia scelta di kit immuno-enzimatici ELISA per la rilevazione e la quantificazione di molecole come le citochine, i fattori di crescita, le proteine da stress, i marcatori tumorali e gli agenti infettanti. I kit ELISA trovano applicazione anche nella determinazione di tossine batteriche, di proteine di OGM e di patogeni negli alimenti. Per ogni kit sono specificate le caratteristiche tecniche quali la sensibilità, il range di concentrazione entro cui il kit funziona e il tipo di matrice del campione. Il test ELISA è utilizzato anche per determinare la presenza di anticorpi sierici diretti contro il virus dell’immunodeficienza umana (HIV), antigene eziologico dell’AIDS.

L'enzima di rilevazione può essere direttamente legato all'anticorpo che riconosce l'antigene (anticorpo primario). Questo viene definito test ELISA diretto. Se invece, l’enzima di rivelazione è coniugato ad un anticorpo secondario che riconosce l'anticorpo primario, si parla allora di ELISA indiretto. Questa variante di ELISA presenta alcuni vantaggi rispetto al metodo diretto:

- E’ più versatile, poiché si possono produrre diversi anticorpi primari in una specie e usare per tutti lo stesso anticorpo secondario marcato.

- L'immunoreattività dell'anticorpo primario non è alterata dalla marcatura.

- La sensibilità è maggiore, perché ogni anticorpo primario contiene diversi epitopi che si possono legare all'anticorpo secondario marcato, permettendo l'amplificazione del segnale. Una ulteriore variante di questo metodo è rappresentato dall’ELISA sandwich. Esso prevede la cattura degli antigeni dal campione sulla parete di micro-cellette ricoperte da anticorpi, detti anticorpi di cattura. L'antigene catturato viene evidenziato ricoprendolo con un secondo strato di anticorpi specifici (anticorpi di rivelazione) con o senza ulteriori fasi di amplificazione. L'anticorpo secondario di rilevazione è coniugato a un enzima e lo sviluppo di una reazione colorimetrica è la dimostrazione della presenza di un determinato antigene. Il sistema sandwich è il più sensibile e specifico per il rilevamento di basse quantità di antigene. Nei sistemi sandwich si possono usare come anticorpi di cattura e di rilevazione:

- monoclonali = specifici verso un singolo epitopo, permettendo la rilevazione fine di piccole differenze quantitative di antigene.

- policlonali = per riuscire a trattenere la maggior quantità possibile di antigene, poi si usa un monoclonale come anticorpo di rilevazione per aumentare la specificità.

Una considerazione importante quando si progetta un saggio ELISA sandwich è che l'anticorpo di cattura e quello di rilevazione devono riconoscere due epitopi non sovrapposti o comunque non troppo vicini. Anticorpi di cattura e di rilevazione che non interferiscono uno con l'altro e che si possono legare contemporaneamente al proprio bersaglio sono considerati una "coppia" e sono adatti per un saggio ELISA sandwich.