Metodi molecolar

Polymerase Chain Reaction (PCR)

La Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) rappresenta il capostipite di tutti i saggi di amplificazione del bersaglio e prevede l’utilizzo di primer specifici, una miscela di nucleotidi liberi e una DNA polimerasi termostabile (Taq polimerasi). Data la semplicità della metodica, la sua ampia applicabilità e l'elevatissima sensibilità (1-10 copie di DNA target), la PCR viene ampiamente usata nella diagnostica di un’infezione da virus sia a DNA che a RNA. In quest'ultimo caso sebbene si possa amplificare direttamente l'RNA, per via della sua instabilità si preferisce usare una RT-PCR (retro-trascrittasi PCR), che prevede la retro-trascrizione dell'RNA virale in cDNA mediante un Trascrittasi Inversa (enzima con proprietà DNA polimerasica-RNA dipendente) [90].

I reagenti necessari per preparare una reazione di PCR sono: - Taq DNA polimerasi

- Buffer con concentrazione bilanciata di Sali (Tris-Hcl, KCl, MgCl2) - Deossiribonucleotidi trifosfati (dNTPs)

- Primers specifici per la regione da amplificare - Acqua distillata RNAasi free.

La reazione di PCR procede ciclicamente attraverso 3 fasi:

- Fase di denaturazione in cui la soluzione di DNA da replicare, deossiribonucleotidi trifosfati, ioni magnesio, primer e TAQ polimerasi viene portata a una temperatura compresa tra 94 e 99 °C. Ciò provoca denaturazione della doppia elica del DNA, i due filamenti di cui essa è composta sono liberi.

- Fase di annealing in cui la temperatura viene abbassata fino a 40-55 °C circa al fine di permettere il legame dei primer alle regioni loro complementari sui filamenti di DNA denaturati.

- Fase di allungamento in cui la temperatura viene alzata fino a 65-72 °C al fine di massimizzare l'azione della TAQ polimerasi che determina un allungamento dei primer legati, utilizzando come stampo il filamento singolo di DNA.

Il ciclo descritto viene ripetuto generalmente per circa 30-40 volte. In genere non si superano i 50 cicli in quanto ad un certo punto la quota di DNA ottenuto raggiunge un plateau. Ciò avviene, ad esempio, per carenza degli oligonucleotidi usati come inneschi o per diminuzione dei dNTP. Bisogna inoltre considerare che si potrebbe amplificare in maniera eccessiva anche eventuale materiale genomico contaminante.

La scelta del bersaglio genetico da amplificare tramite PCR dipende da ciò che si è interessati ad ottenere e per tale motivo si ricorre a differenti strategie. Ad esempio, in caso di malattie infettive si possono amplificare geni del microorganismo in questione che codifichino per funzioni vitali essenziali o per fattori di virulenza. Il bersaglio da amplificare può anche essere una molecola di RNA (come nel caso di alcuni virus) la quale deve essere, come primo passo, sottoposta ad una reazione di retrotrascrizione.

La scelta dei primer da utilizzare costituisce un aspetto essenziale per la buona riuscita della PCR. Essi, infatti, devono potersi ibridare in maniera specifica ed efficiente alla sequenza d'interesse, tralasciando quelle aspecifiche. La tipologia di primer da usare varia a seconda dello scopo della PCR. Nel caso di malattie infettive risulta conveniente ricorrere a primer che siano specie-specifici o che possano efficacemente distinguere tra ceppi patogeni e non. Nell'allestimento di una PCR la distanza compresa tra i due primer è alquanto flessibile e può andare dalle 100 alle 10.000 paia di basi, anche se, in realtà, l'efficienza dell'amplificazione diminuisce quando si superano le 3.000 paia di basi. Per cercare di ovviare a questo problema sono state costruite varianti della DNA polimerasi prive dell'attività esonucleasica (che va dal 5' al 3'). La lunghezza di un primer è, in genere, compresa tra le 20 e le 30 paia di basi e non dovrebbe essere inferiore alle 16 (al fine di non pregiudicare la specificità del processo). Grazie alle banche dati ed alle pubblicazioni scientifiche, stanno diventando sempre più disponibili le sequenze di DNA o di RNA necessarie per poter disegnare i primer da utilizzare nelle PCR. Una volta ottenuta la sequenza d'interesse bisogna controllare che nel resto del genoma non vi siano sequenze omologhe che possano portare alla produzione di falsi positivi e successivamente si può iniziare a disegnare i primer tenendo presente alcune accortezze:

- Il contenuto di GC dovrebbe essere compreso tra il 45 ed il 50%

- I primer non dovrebbero contenere sequenze tra loro complementari oppure sequenze ripetute invertite, per evitare che si formino dimeri di primer o strutture a forcina.

La concentrazione con cui i primer vengono comunemente usati si aggira attorno ad 1 mM e si ritiene che un simile quantitativo sia sufficiente per almeno 30 cicli d'amplificazione. Una concentrazione di primer troppo elevata potrebbe portare all'amplificazione di sequenze non specifiche, mentre, al contrario, una troppo scarsa presenza di primer rende la PCR inefficace. Per allestire una PCR, si

renderà, quindi, necessaria un'ottimizzazione della concentrazione dei primer, tramite diluizioni scalari.

Tra le innumerevoli varianti della reazione a catena della polimerasi, la Nested-PCR garantisce una buona specificità di amplificazione e consiste in due amplificazioni successive (double step) in cui vengono utilizzate due coppie diverse di primer. Nel primo step vengono utilizzati due primer in grado di amplificare un frammento di DNA di una data grandezza. Il prodotto della prima amplificazione verrà utilizzato in una seconda reazione di PCR con una diversa coppia di primer, detti primer interni. Questa metodica consente di limitare le contaminazioni ed aumentare di molto la sensibilità e la specificità rispetto ad una PCR tradizionale.

Un’evoluzione della PCR è rappresentata dalla multiplex PCR dove più coppie di primers vengono utilizzate per amplificare simultaneamente differenti sequenze nella stessa reazione; in questo modo si può arrivare a rilevare fino a 19 virus in un singolo test. Il vantaggio di questo metodo è il considerevole risparmio di sforzi e tempo quando si analizzano differenti regioni bersaglio. Tuttavia questa metodica non è sempre utilizzabile dal momento che tutte le coppie di primers devono funzionare nelle stesse condizioni di amplificazione, con il rischio che si possa avere formazione di dimeri tra primers con conseguente diminuzione della sensibilità del test e/o l’amplificazione preferenziale di alcuni bersagli rispetto ad altri.

Real Time PCR

La Real-Time PCR rappresenta oggi la variante più diffusa nei laboratori di diagnostica virologica in quanto consente la quantificazione del materiale in esame durante l'amplificazione aumentando perciò efficienza del metodo.

La tecnologia della PCR quantitativa Real Time legata alla fluorescenza prevede l’uso di: a) coloranti intercalanti nel DNA in grado di emettere fluorescenza, se opportunamente eccitati b) oppure sonde ad ibridazione, di varie tipologie, legate a molecole fluorescenti ‘reporter” e “quencher” per un approccio sequenza specifico.

Il principio d’uso dei coloranti intercalanti come il SYBR Green si basa sul fatto che la fluorescenza aumenta considerevolmente nel momento in cui la molecola si intercala nel solco minore del DNA a doppio filamento, pertanto, la misura quantitativa della fluorescenza emessa è direttamente proporzionale alla quantità di DNA a doppio filamento presente in ogni campione, a sua volta proporzionale alla quantità di DNA presente nel campione iniziale. La lettura della fluorescenza avviene al termine di ogni ciclo di amplificazione. L'uso di molecole fluorescenti intercalanti è un metodo efficace e relativamente economico, tuttavia questo sistema non è in grado di discriminare tra i prodotti specifici di amplificazione e altri prodotti aspecifici, come dimeri di primer.

L'utilizzo di sonde ad ibridazione è il più accurato e il più affidabile dei metodi, in quanto incrementa significativamente la specificità della reazione. Le strategie utilizzate con le sonde ad ibridazione si possono classificare in 3 diverse categorie:

 Saggi cosiddetti Cleavage Based che comportano un taglio enzimatico della sonda utilizzata chiamata anche Sonda a Idrolisi.

 Saggi “Displaceable Probes” in cui la sonda viene scalzata dal templato a cui si era ibridata e poi riutilizzata

 Saggi che comportano l’uso di sonde o particolari sequenze nucleotidiche legate direttamente a uno dei primers.

La sonda a idrolisi più comune è la sonda TaqMan che ibridizza un tratto di genoma interno al frammento di DNA amplificato dalla coppia di primers. Tale sonda, generalmente lunga 20-30 paia di basi, contiene un fluorocromo ad alta energia (Reporter), solitamente di colore verde all'estremità 5', ed un fluorocromo a bassa energia spegnitore (Quencher), di colore rosso all'estremità 3'. (Figura 4.1)

Figura 5.1 Real Time PCR

In condizioni di normale appaiamento sonda-DNA stampo, se il campione viene irradiato, l'energia fluorescente emessa dal fluorocromo ad alta energia in 5' viene assorbita totalmente dal quencher a bassa energia perciò in assenza del bersaglio non avviene il trasferimento di energia. Nel momento in cui la DNA polimerasi, replicando lo stampo, incontra la sonda appaiata al suo interno, grazie alla sua attività esonucleasica 5' → 3', comincia a degradarla. L’ allontanamento tra il “reporter” ed il “quencher” pone fine all’attività di assorbimento di quest’ultimo di conseguenza il reporter inizia ad emettere fluorescenza che incrementerà a ogni ciclo proporzionalmente al tasso di degradazione della

sonda. L’accumularsi del prodotto amplificato viene rivelato monitorando quindi l’incremento di fluorescenza del reporter. Registrando la quantità di emissione fluorescente per ogni ciclo è possibile monitorare la reazione di polimerizzazione durante la sua fase esponenziale, nella quale il primo incremento significativo di prodotti neo-sintetizzati è collegato alla concentrazione iniziale di stampo nel campione. Infatti, maggiore è il numero di copie iniziali dell'acido nucleico, prima si osserverà un incremento significativo della fluorescenza (Figura 5.1 Real Time PCR).

Con tale strategia è possibile rilevare fino a 20 virus respiratori e monitorare in tempo reale la reazione [92]. Altre tecniche che si sono sviluppate a partire dalla PCR e hanno assunto un ruolo di notevole importanza nella diagnostica virale sono: l’analisi della sequenza genomica di specifiche regioni virali amplificate (questo metodo permette di monitorare ceppi farmacoresistenti, o l'insorgenza di farmacoresistenze in ceppi virali fino a quel momento sensibili) e il DNA microarray che ha mostrato grandi potenzialità nell’ambito della diagnostica virologica.

Anche se la PCR ha sostituito le colture cellulari e la sierologia come tecnica primaria per la rilevazione dei virus, le colture restano comunque un ottimo metodo per la caratterizzazione fenotipica di ceppi virali e per la rilevazione di nuovi virus.

NASBA

L’amplificazione dell’acido nucleico basata sulla sequenza (NASBA) è una tecnica di amplificazione sensibile ed isotermica (41°C), specificatamente designata per bersagli di RNA. Sviluppata negli anni ’90, essa utilizza una batteria di 3 enzimi: una trascrittasi inversa, RNAasi H e T7 RNA polimerasi, i quali creano degli amplificati di RNA a singolo filamento senza utilizzare alcun termociclizzatore. NASBA è una tecnica diagnostica affermata nell’uso clinico, teoricamente con una sensibilità analitica anche maggiore della RT-PCR per la rilevazione di agenti patogeni.

La tecnica utilizza 2 primer fiancheggianti la regione da amplificare. Il primo primer (P1) porta con se’ la sequenza di legame per la T7 RNA polimerasi alla sua estremità 5’ ed è utilizzato per iniziare la trascrizione inversa. Il filamento di RNA nelle molecole ibride RNA-DNA risultanti dalla retrotrascrizione viene degradato dalla RNAasi H. Il cDNA rimanente è quindi accessibile al secondo primer (P2), il quale innesca la sintesi del filamento complementare. Il terzo enzima, la T7 RNA polimerasi, si attacca al 5’ del doppio filamento di DNA neosintetizzato e trascrive molte copie di RNA. Questo ciclo è ripetuto indeterminatamente a partire dai nuovi RNA trascritti. RNA e doppi filamenti di cDNA si accumulano esponenzialmente e possono essere rilevati tramite elettroforesi su gel di agarosio con bromuro di etidio. Questi passaggi avvengono tutti ad una temperatura costante di 41°C, cosicché il DNA genomico rimane sempre intatto come doppio strato e non diventa un substrato per l’amplificazione. La cinetica di reazione è determinata per lo più dall’efficienza

dell’appaiamento dei primer, la quale dipende a sua volta dalla sequenza e dalla struttura dell’RNA target e dalla formazione di prodotti aspecifici durante l’amplificazione.

Questa tecnica offre diversi vantaggi rispetto agli altri metodi di amplificazione di RNA. Per esempio, si possono ottenere oltre 109 copie della sequenza da amplificare in soli 90 minuti. Non servono termociclizzatori, in quanto la reazione è isotermica a 41°C. Essa produce amplificati che sono RNA a singolo filamento, i quali possono essere utilizzati direttamente per un successivo ciclo di amplificazione oppure rilevati senza necessità di una denaturazione dei doppi filamenti. Gli svantaggi del NASBA invece sono rappresentati principalmente dalla difficoltà di mantenere integro l’RNA, così come per RT-PCR ed altre tecniche di amplificazione per RNA. NASBA è comunque una tecnica molto utilizzata in diagnostica per identificare agenti infettivi in diversi tipi di campioni, come sangue, siero, plasma, biopsie nasofaringee e tamponi respiratori.

LAMP

L’amplificazione isotermica loop-mediata (LAMP) è un metodo semplice, rapido e specifico, basato sull’uso di 4 o 6 primer differenti, studiati per riconoscere 6 o 8 regioni della sequenza di interesse. La reazione procede a temperatura costante usando lo strand displacement (dislocazione della catena dell’acido nucleico) e l’amplificazione e la rivelazione della sequenza interessata vengono completate in un solo step, incubando la miscela di campioni, primer e DNA polimerasi con attività di dislocazione a temperatura costante (65°C).

Il metodo è:

- Rapido, grazie all’eliminazione della procedura non necessaria di purificazione dell’RNA, - Specifico, in quanto utilizza 6 primers per amplificare l’mRNA d’ interesse

- Efficace nell’impedire l’amplificazione di DNA genomico, poiché la reazione avviene a temperatura costante.