Campioni Discordant
2° SERIE Identificativo
Campione Tipo di campione Metodi Tradizionali CLART PneumoVir
8 Tampone faringeo INF-A + hPIV-3
(PCR + Isolamento) NEG
17 Tampone faringeo RSV
(PCR) NEG
22 Lavaggio orale RSV
(PCR) NEG
28 Tampone faringeo INF-A
(PCR + Isolamento) NEG
29 Tampone faringeo EV
(PCR) NEG
32 Tampone nasale AdV
(PCR) NEG
38 BAL INF-A
(PCR + Isolamento) NEG
40 Tampone nasale AdV
(PCR) NEG
45 Tampone faringeo AdV
(PCR) NEG
50 Tampone nasale INF-A (H1N1)
(PCR) NEG
53 Tampone nasale RSV
(PCR) NEG
59 Tampone nasale RSV
(Ricerca Antigeni) NEG
2° SERIE Identificativo
Campione Tipo di campione Metodi Tradizionali CLART PneumoVir
11 Tampone faringeo NEG
(Isolamento + Ag) AdV
25 Tampone nasale NEG
(PCR) hPIV-3
39* Espettorato NEG
(PCR) hPIV-3 + RV
44 BAL NEG
(PCR) hPIV-2
63 Tampone nasale NEG
(Isolamento + Ag) AdV
* Nel campione 39, RV non è stato ricercato con la Real-Time PCR, in quanto non richiesto.
I metodi molecolari presentano caratteristiche differenti in termini di specificità e sensibilità rispetto all’isolamento e alla ricerca degli Antigeni Virali, nonostante quest’ultime sono metodiche altamente utilizzate nella comune diagnosi di laboratorio. Differenti valori di sensibilità e specificità, seppur in modo meno evidente, si osservano anche tra le Metodiche Molecolari utilizzate nel nostro studio. La real-time PCR consente di rilevare quantità inferiori alle 10 copie/reazione di genoma target, valore non rilevabile con il Metodo CLART PneumoVir. I valori di sensibilità relativi al metodo CLART PneumoVir e alla Real-Time PCR sono riportati nella Tabella 7H. Questo dato potrebbe fornire una spiegazione attendibile all’analisi dei risultati discordanti osservati nella 1° Serie.
Virus Sensibilità Copie/Reazione
CLART PneumoVir Real-Time PCR
RSV 100 < 10 AdV 100 13 hPIV 1000 20 hMPV 100 20 EV 1000 15 INFV 100 < 10
Tabella 7H – Valori di sensibilità relativi al metodo CLART PneumoVir e real-time PCR espressi in copie/reazione
I risultati della 2° serie riportati in tabella 7G sono stati ulteriormente suddivisi in base alla tipologia di esame, al fine di poter effettuare un’analisi dettagliata. I campioni 11 e 63 sono stati processati solamente per l’isolamento e la ricerca degli antigeni virali adeno-specifici. Questi metodi di rivelazione risultano generalmente essere meno efficienti rispetto alle tecniche molecolari, in quanto necessitano di una cospicua quantità di particelle virali vitali all’interno del campione. E’ quindi necessario garantire una corretta esecuzione, trasporto e conservazione del prelievo affinché’ il risultato non sia influenzato da errori.
I campioni 25, 39 e 44 positivi con il CLART PneumoVir sono stati analizzati invece mediante PCR Real-Time. Non potendoci avvalere di un ulteriore controllo dato dall’Isolamento e dall’Antigenicità Virale, i 3 dati discordanti potrebbero essere correlati ad un problema di efficienza di estrazione o di qualità del campione. E’ ben nota, infatti, l’elevata degradabilità del RNA da parte delle ribonucleasi. Inoltre i diversi sistemi di rilevazione utilizzano diverse procedure di estrazione: manuale, mediante un Kit interno, per CLART PneumoVir ed invece automatizzato (QIA Symphony) per la Real-Time PCR.
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DISCUSSIONE
Le infezioni dell’apparato respiratorio (RTI) sono causa significativa di morbilità e mortalità in paesi industrializzati e in via di sviluppo, soprattutto in età pediatrica e senile. La World Health Organization (WHO) ha stimato che le RTI sono causa di oltre 4 milioni di morti all’anno. L'immunità acquisita dopo un’infezione respiratoria è di breve durata, in quanto gli agenti eziologici più comuni sono scarsamente immunogeni e molti agenti infettivi, soprattutto virus, vanno periodicamente incontro a variazioni antigeniche che vanificano in parte o completamente la risposta immunitaria [99]. Queste infezioni hanno un grosso impatto economico, sia in termini di costi per i ricoveri ospedalieri, sia per la diagnosi e la cura [100]. L'elevata incidenza, la severità con cui queste patologie frequentemente si manifestano, il gran numero di patogeni responsabili di queste affezioni e la difficoltà di effettuare una diagnosi clinica a causa della sovrapposizione dei quadri sintomatologici, portano queste malattie ad avere una notevole ricaduta sui laboratori di Microbiologia e Virologia, in termini di richiesta di esami diagnostici. L’individuazione rapida e sensibile dei virus respiratori è necessaria per una diagnosi precoce e mirata che consente l’attuazione delle misure di controllo adeguate. I saggi molecolari sono le nuove metodiche utilizzate nella rilevazione dei virus. La loro attuale diffusione è dovuta alla loro elevatissima sensibilità e specificità (vicine al 100%), al fatto che riescono a distinguere tra sottotipi virali non individuabili con altri saggi e che consentono di rilevare gli acidi nucleici presenti nel campione da analizzare indipendentemente dallo stato dell’infezione (passata o in corso) e dalla quantità o tipologia del campione biologico. Dal momento che tale metodo non necessita dell’integrità del virus, non è sempre possibile correlare la presenza del genoma virale ai sintomi della malattia in corso. Tale limite è stato superato dall’introduzione della Real-Time PCR, che permette di quantificare le copie del genoma virale in modo da permettere il monitoraggio
dell’efficacia di un’eventuale terapia o il decorso dell’infezione virale correlati alla carica virale nei campioni. Tuttavia, a causa della frequenza con cui le infezioni respiratorie virali presentano sintomi clinici sovrapponibili, risulta spesso necessaria la ricerca di più virus che potrebbero essere implicati nella patologia, con la necessità dell’esecuzione di più test e un alto dispendio economico. E’ proprio in tale contesto che si inserisce il nostro studio.
Grazie ai grandi miglioramenti nelle tecniche molecolari ed all’enorme sviluppo della tecnologia relativa a fotolitografia, stampaggio e miniaturizzazione, si è arrivati in questo ultimo decennio a creare una nuova strategia per identificare particolari sequenze di materiale genetico all’interno di un campione biologico. Molto rapidamente, la tecnologia microarray si è dimostrata utilissima sia nello studio dei profili d’espressione genica, sia negli studi filogenetici, ma sta rivoluzionando in particolar modo la diagnosi di infezioni virali e batteriche.
In questo settore, Joseph L. DeRisi dell’Howard Hughes Medical Institute (Maryland – Stati Uniti) ha recentemente creato il ViroChip microarray, un potentissimo test diagnostico in grado di individuare contemporaneamente in un campione biologico tutti i possibili virus conosciuti ed anche quelli non ancora scoperti. Il ViroChip deve la sua grande capacità discriminativa ad oltre 22.000 sonde oligonucleotidiche stampate su un supporto di vetro di pochi centimetri quadrati, le quali
rappresentano le 1.800 sequenze appartenenti a differenti virus contenuti nella GenBank. La strategia con cui vengono selezionate queste sonde si basa su 2 criteri. Il primo è quello di
selezionare, come sonde, sequenze di 70 nucleotidi filogeneticamente conservate all’interno di ciascuna famiglia al fine di massimizzare la cross-ibridazione e di rendere individuabili anche quei virus non ancora sequenziati o conosciuti. Il secondo criterio consiste nell’aggiungere al ViroChip delle sequenze di 70 nucleotidi più specifiche con l’obbiettivo di discriminare tra le varie famiglie e ceppi virali. Le prestazioni del Virochip nel rilevamento dei virus respiratori presentano una sensibilità elevata, fino a 100 copie/reazione ed una specificità fino al 100%. Esso rappresenta il più robusto approccio diagnostico per la conferma di un infezione virale grazie alla possibilità di rilevare più virus contemporaneamente, in un'unica seduta, partendo da uno stesso campione. E’ noto, infatti, come lo stesso agente virale possa causare quadri clinici diversi e, viceversa, come il medesimo quadro sintomatologico possa essere attribuito a differenti patogeni. Per tale motivo la precisa definizione del ruolo eziologico può avvenire solo tramite indagini specifiche.
Il Laboratorio di Virologia Universitaria dell’Azienda Ospedaliera Pisana – Dipartimento di Ricerca Traslazionale, delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia ha deciso di affiancare alle metodiche diagnostiche classiche per il rilevamento di virus respiratori la tecnologia microarray, acquistando il CLART PneumoVir kit® prodotto da Genomica. Tale metodo ha un’elevata efficienza in termini di
laboratorio. Con un unico esame CLART PneumoVir è in grado di rilevare 19 virus: Adenovirus; Bocavirus; Coronavirus; Enterovirus (Echovirus); Influenza virus (sottotipi A/H3N2, A/H1N1, B, C e A/H1N1/2009); Metapneumovirus (sottotipi A e B); Parainfluenza virus 1, 2, 3 e 4 (sottotipi A e B); Rhinovirus; Virus Respiratorio Sinciziale tipo A (RSV-A) e tipo B (RSV-B).
L’obbiettivo del nostro studio è stato quello di saggiare l’efficienza e la correttezza dei risultati di questa innovativa tecnica diagnostica, nello specifico campo delle infezioni virali dell’apparato respiratorio. Negli ultimi anni stanno emergendo numerose prove sperimentali a sostegno di questa nuova tecnologia, preparando il campo per l’approvazione al suo impiego nella routine diagnostica.
I campioni analizzati in questo studio appartengono a pazienti con sintomi correlati ad infezioni del tratto respiratorio, pervenuti al laboratorio di Virologia Universitaria dell’Azienda Ospedaliera Pisana – Dipartimento di Ricerca Traslazionale, delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia nel periodo che intercorre tra Maggio 2013 e Marzo 2014. Lo studio è stato eseguito su un gruppo eterogeneo di 70 pazienti di età compresa tra i 3 mesi e i 75 anni, con una netta prevalenza di bambini in età pediatrica e di adulti oltre i 50 anni, le due fasce di età a maggior rischio di evoluzione delle infezioni respiratorie verso patologie gravi. La maggior parte dei campioni erano stati inviati dai reparti di Neonatologia, Pediatria e Malattie Infettive. Un'aliquota (500 L) dei campioni in esame è stata sottoposta al test con la tecnologia CLART PneumoVir kit® (Genomica) mentre il resto del campione è stato processato, in base alla richiesta effettuata dai reparti, nel settore dell'Isolamento Virale, e in quello della Diagnostica Molecolare secondo il Protocollo Operativo descritto nella sezione Materiali e Metodi (Capitolo 3). Nella maggior parte dei casi il sospetto clinico d’infezione da virus respiratori è stato confermato col test di laboratorio: 28 (40%) campioni sono risultati negativi, 42 (60%) positivi per almeno un’infezione virale mentre 8 campioni di questi hanno mostrato una positività a più di un virus per un totale di 51 virus rilevati attraverso il pannello CLART PneumoVir. Il maggiore valore di prevalenza è risultata quella l’RSV 37 %, seguita da quella del Virus Influenzale 29%, dell’Adenovirus 14% e del Virus Parainfluenzale 8%. Tra i risultati ottenuti abbiamo riscontrato basse percentuali di positività per Rhinovirus, Enterovirus, Coronavirus, Bocavirus e Metapneumovirus. Tali risultati sono in linea con i dati riportai dal CDC, Center for Desease Control and Prevention. Come descritto in letteratura e dimostrato nel nostro studio, l’RSV è il virus con una maggiore prevalenza nella popolazione soprattutto nel periodo invernale e questo correla con la sua stagionalità. Il sottotipo B è noto dare infezioni meno severe rispetto al sottotipo A, frequentemente associato a gravi patologie delle basse vie respiratorie (bronchioliti e polmoniti). Il tipo A è stato maggiormente riscontrato nel campione di pazienti da noi esaminato (11 positivi per RSV-A ed 8 per RSV-B).
Abbiamo riscontrato ben 16 di queste positività in campioni provenienti dalla Pediatria/Neonatologia, indice di un picco di infezione nei primi 6 mesi di vita nei soggetti di età pediatrica.
15 campioni sono risultati positivi al Virus Influenzale di cui 10 per il sierotipo B, mentre 5 per sierotipo A/H1N1 2009, virus pandemico di origine suina. La maggior parte dei campioni positivi per INFV è stata registrata a fine gennaio 2014, periodo relativo al picco della curva epidemica delle sindromi influenzali. Il picco d’incidenza, raggiunto nella sesta settimana del 2014, pari a 6,62 casi per 1000 assistiti, è inferiore a quello osservato nella maggior parte delle precedenti stagioni influenzali, tuttavia si osserva una maggiore durata del periodo epidemico e questo concorda con i nostri dati. In realtà spesso le sindromi acute respiratorie in questo periodo vengono in maggior misura diagnosticate clinicamente senza ricorso al Laboratorio di Virologia e questo può essere associato alla bassa presenza di casi da noi riscontrati.
Inoltre, come confermato dalla letteratura, l’RSV è spesso stato identificato in casi di co-infezioni. (Tabella 7C). In particolare, grazie all’utilizzo della tecnologia CLART PneumoVir, sono stati individuati 5 casi di co-infezioni doppie o multiple, nelle quali l’RSV rappresentava uno degli agenti patogeni implicati: hMPV-B + RSV-B; INF-B + RSV-A; RSV-A + hMPV-B + INFV-A(H1N1); RSV-A + hPIV4; CoV-229E + RSV-A. In quest’ultimo caso il Coronavirus da noi riscontrato (CoV- 229E) è frequentemente associato a sindromi respiratorie gravi con un’incidenza del 5-30% [85]. Anche in Italia nel 2013 sono stati confermati tre casi d’infezione da nuovo Coronavirus. Non sempre è possibile identificare precocemente i pazienti con CoV-229E perché́ alcuni presentano sintomi lievi o inusuali [83]. Effettuare pertanto uno screening in prima battuta di tutti gli eventuali virus respiratori in pazienti in cui si sospetta l’infezione sarebbe estremamente utile e consentirebbe di adottare adeguate misure di sicurezza (ad esempio, la quarantena) per impedire un’eventuale diffusione del virus e di eseguire studi epidemiologici per la somministrazione di un eventuale vaccino alla popolazione a rischio.
Di grande impatto, è stata l’identificazione di human Metapneumovirus (hMPV), isolato per la prima volta nel 2001 [87] e di human Bocavirus (hBoV) nel 2005 [48] tra i pazienti selezionati nel nostro campione. Il hMPV è ora riconosciuto essere responsabile per circa il 10 % delle infezioni respiratorie, soprattutto nei bambini sotto i cinque anni di età [22]. Anche il hMPV è frequentemente coinvolto in casi di coinfezione con RSV così come osservato nei nostri dati. Un altro risultato interessante è stato quello di un campione proveniente da un soggetto di 4 anni di età che presentava una co-infezione di INF-B e hBoV. Le co-infezioni del hBoV con altri virus respiratori sono molto frequenti, ma tale condizione non sembrava tuttavia incidere in modo particolare sulla gravità della patologia del soggetto. I dati presenti in letteratura suggeriscono che il hBoV è correlato ad una maggiore prevalenza nei bambini più piccoli e nei neonati, forse perché più suscettibili all’infezione
virale oppure a causa dello stato di attiva proliferazione in cui si trovano i loro tessuti, rappresentando un substrato migliore per le necessità replicative del virus. Sono molto meno frequenti, invece, i riscontri in pazienti adulti. [102]
Le informazioni ottenute dall’analisi eseguita con questa innovativa metodica, potrebbero guidare verso un aggiornamento dei pannelli diagnostici in uso, includendo nuove specie virali che sono risultate presenti nei campioni analizzati in quantità tale da suggerire la circolazione del virus nella zona d’interesse, e verso le quali non sono ancora disponibili metodiche diagnostiche standard. La metodica CLART PneumoVir assume, in questo contesto, una notevole vantaggio rispetto alle metodiche standard e rappresenta un approccio estremamente interessante nella valutazione epidemiologica di virus ancora non completamente caratterizzati e conosciuti.
Il confronto tra i risultati diagnostici ottenuti con le due diverse metodiche (CLART PneumoVir e Metodi Tradizionali), effettuato su 70 campioni, ha mostrato una buona concordanza, pari al 76%,
mentre il restante 24% ha mostrato un risultato discordante in termini di positività e negatività. In particolare su 49 campioni positivi con i Metodi Tradizionali, 12 (17%) erano in realtà negativi
quando processati con la metodica CLART PneumoVir, mentre 5 campioni su 42 positivi per la
metodica CLART PneumoVir erano negativi all’analisi con i Metodi Tradizionali. (Tabella 7G). Per quanto riguarda le cause responsabili della prima serie di discordanze (Metodi Tradizionali
positivi / CLART PneumoVir negativi) potrebbero essere correlate alle differenti caratteristiche di specificità̀ e sensibilità delle metodiche utilizzate. La Real-Time PCR consente di rilevare quantità inferiori alle 10 copie/reazione di genoma target, valore non riscontrabile con il Metodo CLART PneumoVir che presenta una capacità di rilevazione dell’ordine di 100 copie/reazione come riportato nella tabella 7H nella sezione dei Risultati. Il calcolo della quantità di genoma virale nel campione viene effettuata determinando il Ciclo Soglia (Ct) che, come abbiamo ampiamente descritto nel Capitolo 3, è inversamente proporzionale al numero di copie target presente inizialmente. Maggiore è la quantità di DNA iniziale, prima verrà rilevato l’aumento di fluorescenza, minore sarà il valore di Ct. I risultati dei campioni riportati nella 1° serie in tabella 7G presentavano dei valori di (Ct) decisamente alti (da 30 a 39 Ct). Come esempi, riportiamo i campioni 32 e 53 risultati positivi per AdV e RSV, i quali mostravano un valore di Ct rispettivamente di 38 e 39, indici di una bassa presenza di copie di genoma virale nel materiale iniziale.
Per quanto riguarda invece la seconda serie di risultati discordanti (Metodi Tradizionali negativi / CLART PneumoVir positivi), c’è bisogno di porre la nostra attenzione alla tipologia di esame eseguito come metodica standard. I campioni 11 e 63 sono stati processati per l’Isolamento e la ricerca degli Antigeni Virali Adeno-specifico. A causa della loro scarsa sensibilità, questi metodi di
rilevazione risultano essere meno efficienti rispetto alle metodiche molecolari. L’Isolamento Virale e l'Immunofluorescenza (come descritto nel Capitolo 3) presuppongono la presenza di particelle virali vitali ed un’adeguata quantità di antigene virale nel campione. Per questa ragione la corretta esecuzione, il trasporto e conservazione del prelievo rappresentano un elemento fondamentale per garantire l'efficacia e la validità del metodo. Per i campioni respiratori, spesso difficili da trattare, i metodi più attendibili per una diagnosi rapida e dettagliata risultano essere quelli molecolari che
consentono inoltre di tipizzare il virus rilevato e di poter effettuare anche studi epidemiologici. I campioni 39, 25 e 44 positivi con il CLART PneumoVir sono stati analizzati invece mediante PCR
Real-Time. Non potendoci avvalere di un ulteriore controllo dato dall’Isolamento e dall’Antigenicità Virale, i 3 dati discordanti potrebbero essere correlati ad un problema di efficienza di estrazione o di qualità del campione. E’ ben nota, infatti, l’elevata degradabilità del RNA a da parte delle ribonucleasi. Inoltre i diversi sistemi di rilevazione utilizzano diverse procedure di estrazione: manuale, mediante un Kit interno, per CLART PneumoVir ed invece automatizzato (QIAsymphony) per la Real-Time PCR.
L’istogramma in Figura 8.1 mostra il confronto del numero di virus individuati dai Metodi Tradizionali e dal CLART PneumoVir, suddividendoli in base al tipo di campione. La differenza tra il numero totale dei virus rilevati mediante il CLART PneumoVir rispetto a quello dei Metodi Tradizionali appare trascurabile: 51 e 52 virus rispettivamente.
Figura 8.1 – Confronto del numero di virus rilevati rispetto al tipo di campione analizzato tra Metodi Tradizionali e CLART PneumoVir 0 5 10 15 20 25 30 35 Tampone Nasale Tampone Faringeo
Broncolavaggio Espettorato Gargarizzato Lavaggio orale 32 15 3 1 0 0 29 20 2 0 0 1