Suddivisione per tipo dei 70 campione in esame
6.3 Virologia molecolare
Nel settore molecolare il campione viene sottoposto ad estrazione dell'acido nucleico e successiva amplificazione. La preparazione dei campioni biologici potenzialmente infetti avviene sotto cappa:
I tamponi nasali/faringei pervenuti a secco vengono pre-trattati con una soluzione di lisi (ATL) per facilitare il rilascio di una maggiore quantità̀ di materiale. Incubare il campione a 56°C per 15 minuti.
BAL ed espettorati particolarmente difficili da trattare vengono incubati almeno 15 minuti a temperatura ambiente con aggiunta di N-acetil-cisteina al fine di fluidificare il campione. L’estrazione e purificazione di DNA e di RNA da campioni biologici avviene automaticamente tramite estrattore QIAsymphony che garantisce tempi di esecuzione del processo estremamente rapidi. Questo metodo, utilizza la silice magnetica per estrarre gli acidi nucleici dal campione biologico in esame. In ambiente con forti concentrazioni di sali, gli acidi nucleici legano le particelle di silice costituendo la fase solida di estrazione. Attraverso cicli di lavaggi, i componenti diversi dagli acidi nucleici vengono eliminati e al termine dell’estrazione gli acidi nucleici vengono eluiti dalla fase solida in un volume di 60 μL, in base al programma selezionato dall’operatore. L’estrattore avviato procede nell’esecuzione delle quattro fasi operative in forma completamente autonoma, senza la necessità di alcun intervento da parte dell’operatore.
Il protocollo prevede:
1. Lisi dell’involucro virale, con la conseguente liberazione degli acidi nucleici contenuti ed inattivazione di RNasi e DNasi: 350 μL di campione.
2. Legame alla silice: 100 μL di silice, costituita da biglie magnetiche, sono stati aggiunti a ciascun campione lisato.
3. Lavaggi: sono stati effettuati 4 lavaggi utilizzando 3 diversi buffer a composizione non nota.
4. Eluizione: dopo 5 minuti di incubazione a 60°C in un buffer di eluizione (a composizione non nota), la silice magnetica è stata eliminata e l’acido nucleico rimasto nel buffer di eluizione trasferito in provette.
L’estratto ottenuto è stato utilizzato direttamente per le analisi molecolari e successivamente conservato a -20°C. Tutti i campioni sono stati sottoposti ad amplificazione genica mediante Real-Time RT-PCR. L’amplificazione viene effettuata adottando la tecnica delle sonde Taq-man. Le miscele di amplificazione vengono preparate in un laboratorio fisicamente e funzionalmente separato da quello di estrazione per evitare contaminazioni. Prima dell’utilizzo è necessario scongelare completamente i reagenti nel blocco refrigerato a temperatura ambiente:
Mescolarli delicatamente/centrifugarli;
La miscela di amplificazione (premix) è pronta all’uso e contiene: i primer, dNTP, il tampone
di amplificazione, la Taq-Polymerasi e le sonde di ciascuno dei parametri virali nonché le
sonde e i primer specifici del IC introdotto dall’estrazione;
Miscelare bene le premix al fine di garantire distribuzione omogenea dei reagenti nelle provette d’amplificazione;
Dispensare 15l delle premix di amplificazione nelle provette di amplificazione poste su di un blocco refrigerato.
Per valutare l’efficienza di estrazione e/o amplificazione, così come richiesto da protocollo, si utilizza un controllo interno (IC) che è definito nel set di controllo del test corrispondente. In un laboratorio fisicamente e funzionalmente separato per evitare contaminazioni, all’atto di ogni serie di amplificazione aggiungere:
10 l di ciascun campione estratti in una provetta riempito con la premix di amplificazione corrispondente al virus ricercato;
10 l di Controllo di Sensibilità (SC) nella provetta corrispondente che consente di convalidare le prestazioni del kit nel corso del tempo;
10 l di standard (QS) nella provetta corrispondente;
10 μL di IC/W0 estratti nella provetta corrispondente (controllo negativo fornito dal kit e trattato come un campione a partire dall’estrazione);
I 20μl della reazione vengono aliquotati in una “Optical Fast 96 plate” specifica per l’apparecchio AbiPrism 7900 col quale vengono analizzate le reazioni. La piastra viene centrifugata a 1000 rpm per 50 secondi prima di venire inserita nello strumento.
Le condizioni dei cicli di PCR cambiano in base al virus ricercato. Nell’ambito della diagnosi di un’infezione respiratoria i prelievi dei campioni testati possono essere difficili e non sempre effettuati in maniera corretta. In alcuni casi il campione in esame può risultare privo di cellule, e generare di conseguenza un risultato “falso negativo” a causa della qualità del prelievo.
Il controllo di cellularità (Cc) fornisce la convalida della negatività di un test. Il Cc consente di stabilire il numero di cellule presenti nel campione prelevato grazie all’utilizzo degli Standard di quantificazione (QS1, QS2), rispettivamente 104 copie/l e 103 copie/l forniti dal Kit. Ogni
campione viene amplificato contemporaneamente con una premix specifica del patogeno ricercato da una parte e dall’altra con il Cc.
La Real-Time PCR monitora la fluorescenza emessa durante la reazione come indicatore della produzione di amplificati durante ogni ciclo e questo è reso possibile dall’utilizzo di un reporter fluorescente. Le sonde d’ibridazione, infatti, sono marcate in modo diverso:
Una FAM (6-carboxy-fluorescein) come reporter fluorescente legato covalentemente all’estremità in 5’;
L’altra TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) come quencher fluorescente legato covalentemente all’estremità 3’.
Le due sonde si legano a frammenti interni della sequenza amplificata e, una volta avvenuta l’ibridazione, l’attività 5’ esonucleasica della Taq-Polimerasi rompe la sonda interna durante la fase di estensione, generando l’emissione di un segnale di fluorescenza. La possibilità di utilizzare vari tipi di fluorocromi per marcare sonde diverse consente di rilevare contemporaneamente più di una sequenza target in una sola reazione. Appositi software sono in grado di acquisire lo spettro di emissione di ogni singolo campione per tutta la durata della PCR convertendo la variazione di fluorescenza del “reporter” in una rappresentazione in tempo reale della cinetica d’amplificazione. In maggiore dettaglio, l’algoritmo di analisi calcola l’emissione del “reporter” (R) e del “quencher” (Q) ogni pochi secondi. I valori di Rriflettono la quantità di sonda fluorescente e possono essere rappresentati in un grafico in funzione del numero dei cicli come riportato in Figura 6.2.
Figura 6.2 Esempio grafico di amplificazione di PCR real-time
Il calcolo della quantità di DNA dei campioni viene effettuata determinando il Ciclo Soglia (Ct). Il ciclo soglia rappresenta pertanto il valore al quale si osserva un significativo aumento di fluorescenza e si verifica quando il sistema capta un aumento del segnale associato alla crescita esponenziale dei prodotti di PCR durante la fase logaritmica-lineare. Il numero dei cicli necessari perché un campione raggiunga il suo Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presente inizialmente. Maggiore è la quantità di DNA iniziale, prima verrà rilevato l’aumento di
fluorescenza, minore sarà il valore di Ct. Il vantaggio in termini di precisione e di intervallo di quantificazione rispetto alla PCR tradizionale, è dovuto alla possibilità̀ di quantificare il DNA al ciclo soglia, che è sempre calcolato nella fase esponenziale della reazione PCR, fase in cui i reagenti sono ancora lontani dall’esaurimento e gli elementi di variabilità ridotti al minimo.
6.4
CLART PneumoVir Kit
Nei 70 campioni scelti, gli acidi nucleici DNA ed RNA sono stati estratti con un kit interno al CLART PneumoVir e successivamente trattati secondo protocollo operativo, qui sotto riportati. In ogni seduta analitica deve essere incluso fin dalle prime fasi di lavoro un controllo negativo (K-) costituito da 200L di H2O DNA-RNA free che viene trattato analogamente agli altri campioni.
Estrazione degli acidi nucleici
Nell'area di pre-PCR si effettua l’estrazione sotto cappa a flusso laminare: 1. Scongelare i campioni e il controllo negativo.
2. Agitare il campione per risospendere eventuali sedimenti. 3. Trasferire 200 L di campione in una provetta sterile da 1,5 mL,
4. Aggiungere 600L di extraction solution (SEML) opportunamente scongelata. 5. Agitare accuratamente la provetta.
6. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
7. Aggiungere 600L di Isopropanolo freddo (conservato a -20°C). 8. Agitare accuratamente la provetta per inversione.
9. Centrifugare a 13000 r.p.m. per 20 minuti, preferibilmente a 4°C. 10. Rimuovere il surnatante.
11. Aggiungere 1 mL di Etanolo al 70% freddo (tenuto a -20°C).
12. Agitare delicatamente per rimuovere il precipitato dal fondo della provetta. 13. Centrifugare a 13000 rpm per 15 minuti, preferibilmente a 4°C.
14. Rimuovere il surnatante usando una micropipetta avendo cura di non risospendere o rimuovere il pellet.
15. Lasciare i campioni aperti sotto cappa fino a completa essiccazione del pellet (15-20 minuti). 16. Controllare che non vi siano residui di etanolo (residui di etanolo nel campioni possono inibire
RT-PCR
Lavorare sotto cappa a flusso laminare nell'area di pre-PCR durante le fasi di allestimento delle mix di amplificazione, possibilmente tenendo le provette in ghiaccio ben separate. Il kit fornisce 2 provette di amplificazione, una incolore ed una verde, contenenti i primer specifici necessari per l'amplificazione del genoma dei 19 virus compresi nel pannello.
La provetta incolore (multiplex- PCR 1) permette l'amplificazione del genoma di: Coronavirus;
Metapneumovirus (sottotipo A e B); Parainfluenza virus 1,2,3 e 4 (sottotipo A e B); RSV-A. La provetta verde (multiplex-PCR 2) permette l'amplificazione del genoma di: Adenovirus;
Bocavirus; Echovirus; Influenza A, B, C e sottotipi A H1N1/2009 ed A H3/N2; Rhinovirus; RSV-B. 1. Per ogni campione processato nella seduta (incluso il K-) scongelare in ghiaccio le 2 provette
di amplificazioni verde ed incolore
2. Centrifugare le provette di amplificazione per qualche secondo per raccogliere sul fondo il liquido presente
3. Aggiungere in entrambe le provette 2L di enzyme mixture contenente la retro-trascrittasi e la DNA-Polimerasi
4. Aggiungere poiL di campione estratto e risospeso in ogni provetta 5. Spipettare per omogeneizzare la mix di amplificazione ed il campione 6. Programmare il termociclatore (Tabella 6A).
1 ciclo 45°C x 45 min 95°C x 15 min 45 cicli 95°C x 0,5 min 50°C x 1,5 min 68°C x 1 min 1 ciclo 68° x 10min MANTENIMENTO A 4°C
Visualizzazione dell’amplificato
Lavorare nell'area di post-PCR durante le fasi di allestimento dei tubi di amplificazione.
1. Denaturare l'amplificato 95°C per 8 minuti, programmare il termociclatore a 95°C per 10 minuti in modo tale che passati gli 8 minuti il campione rimanga comunque a temperatura durante le fasi di rimozione delle provette
2. Porre immediatamente il campione denaturato in ghiaccio 3. Lavare preliminarmente gli array-tube (AT)
Aggiungere 300L di diluted TL solution Invertire 10-15 volte gli array-tube
Svuotare gli array-tube preferibilmente con l'ausilio di una pompa a vuoto 4. Ripetere l'operazione del punto 3 una seconda volta
5. Aggiungere in AT 100 L di soluzione di ibridizzazione (SH solution) a temperatura ambiente 6. Aggiungere in AT 3 L di campione amplificato e denaturato da entrambe le provette di
amplificazione (verde ed incolore)
7. Risospendere accuratamente con la micropipetta senza toccare l'array posto sul fondo del tubo 8. Incubare a 50°C per 90 minuti a 550rpm in thermoblock
9. Rimuovere SH solution dal tubo 10. Impostare il thermoblock a 30°C
11. Lavare AT con 300L di diluted TL solution ed invertire la provetta 10-15 volte, lasciare la diluted TL solution nel tubo fino a quando il thermoblock non sia arrivato in temperatura, quindi rimuovere la soluzione di lavaggio
12. Aggiungere 100L di diluted CJ solution 13. Incubare a 30°C per 15 minuti a 550 rpm 14. Rimuovere velocemente diluted CJ solution
15. Lavare velocemente AT aggiungendo 300L di diluted TL solution invertendo 10-15 volte 16. Rimuovere la soluzione di lavaggio.
17. Lavare AT aggiungendo 300L di diluted TL solution invertendo 10-15 volte rimuovere con cura la soluzione di lavaggio, anche eventuali residui presenti lungo le pareti o nel tappo del tubo, in quanto potrebbero reagire con RE solution creando un segnale aspecifico (in questa fase finale è raccomandato non lavorare con oltre 12 campioni per volta).
18. Aggiungere 100L di substrato (RE solution) in AT, evitando la formazione di bolle. 19. Incubare a 25°C per 10 minuti, senza agitazione.
21. Leggere immediatamente i campioni in modo sequenziale.
Lettura dei risultati
La lettura dei campioni viene eseguita in modo automatico dallo strumento che acquisisce l'immagine del microarray rilevando gli spot di precipitazione (Figura 6.3).
Figura 6.3 – Visualizzazione dei risultati
Sul microarray vi sono una serie di spot di allineamento con cui lo strumento riesce, indipendentemente da come si carica la provetta nella camera di lettura, ad orientare il piano cartesiano dell'immagine. Una volta acquisita l'immagine lo strumento riconosce la posizione (X;Y) degli spot di reazione, e fornisce il risultato in base all'intensità dello spot ed alla posizione di quest'ultimo, in quanto ad ogni paio di coordinate corrisponde una specifica sonda di ibridazione. I precipitati dei controlli interni devono essere allineati dietro ai metalli-marker della piattaforma, solo in questo modo la processazione è ritenuta valida (Figura 6.4).
L’immagine viene automaticamente elaborata dal software dello strumento e il risultato in output è rappresentato da una tabella a tre colonne riportante: il nome della specie e del sottotipo dei virus del pannello, il risultato qualitativo (positivo, negativo e di incertezza) per ogni virus del pannello e la validità del campione data dal controllo interno di estrazione ed amplificazione. Fornisce inoltre i valori di assorbanza relativi ad ogni virus e consente all'operatore, di verificare che l'immagine rilevata dallo strumento sia pulita poiché eventuali segnali aspecifici potrebbero determinare false positività se venissero letti dallo strumento come spot di reazione (Figura 6.5).
7
RISULTATI
7.1
La popolazione oggetto di studio
La popolazione, oggetto del nostro studio, è rappresentata da campioni pervenuti al Laboratorio dell’U.O Complessa di Virologia dell’Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana (A.O.U.P) - Dipartimento di Ricerca Traslazionale, delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia nel periodo che intercorre tra Gennaio 2012 e Marzo 2014. Sono stati analizzati con i metodi in uso nella routine diagnostica del Laboratorio di Virologia, 2.900 campioni provenienti da pazienti con sospette Infezioni Respiratorie. Quei virus con il maggior numero di richieste diagnostiche sono stati Influenza Virus (1050), RSV (970) ed Adenovirus (500), seguiti da un volume di richieste molto inferiore per Parainfluenza Virus (100), Enterovirus (200) e Metapneumovirus (80). I campioni risultati positivi ai test diagnostici tradizionali (isolamento virale, immunofluorescenza, RT-PCR) sono stati 1.800 (62%), tra cui spiccano RSV, Influenza Virus ed Adenovirus con rispettivamente 700, 600 e 345 positività. Per quanto riguarda i Virus dell’Influenza, anche quest’anno si è avuta la contemporanea circolazione di ceppi di tipo A e di tipo B, sebbene i virus di tipo B siano risultati prevalenti (58%) rispetto ai virus di tipo A (42%). Nell’ambito del tipo A, sono stati prevalentemente isolati e/o identificati virus appartenenti al sottotipo H1N1pdm09 (80%), rispetto ai ceppi H3N2 (13%). Il restante 7% dei ceppi di tipo A non è stato sottotipizzato. Nell’ambito dei virus influenzali di tipo B, entrambi i lineaggi (B/Victoria/2/87 e B/Yamagata/16/88) hanno co-circolato durante l’intera stagione influenzale, sia pure con la netta prevalenza dei ceppi del lineaggio Yamagata (98%). [103] L’istogramma in figura 7.1 mostra la prevalenza dei virus respiratori all’interno della popolazione in esame. I risultati mostrano una prevalenza del 39% per RSV, del 33% per il Virus Influenzale e 19%
per l’Adenovirus. Enterovirus, Parainfluenza Virus e Metapneumovirus sono stati rilevati con percentuali assai meno rilevanti.
Figura 7.1 – Prevalenza (%) dei virus respiratori riscontrata nella popolazione (2900 campioni) analizzata nel periodo Gennaio 2012 - Marzo 2014
Per il nostro studio comparativo tra le metodiche diagnostiche classiche e la tecnologia microarray rappresentata dal CLART PneumoVir, da questa popolazione è stato selezionato un gruppo eterogeneo di 70 campioni provenienti da pazienti di età compresa tra i 3 mesi e i 75 anni.
La maggior parte dei campioni sottoposti ai test proveniva da pazienti ospedalizzati di età pediatrica e con sintomi respiratori gravi correlati a Infezioni del Tratto Respiratorio. L’intervallo di tempo su cui si basa la nostra indagine va da Maggio 2013 a Marzo 2014. Il periodo di riferimento scelto permette di considerare l’andamento stagionale dei virus respiratori, che mostrano generalmente una maggior incidenza nei mesi invernali. Abbiamo utilizzato il test chi-quadro di Pearson per dimostrare che il campione utilizzato per lo studio di comparazione è rappresentativo della popolazione.
Un'aliquota (500L) dei 70 campioni esaminati è stata immediatamente congelata a -80°C e mantenuta in queste condizioni fino al momento dell’analisi con il metodo CLART PneumoVir kit® (Genomica) mentre il resto del campione è stato processato, in base alla richiesta effettuata dai reparti, secondo il protocollo di isolamento virale e di biologia molecolare nel nostro laboratorio.
0 200 400 600 800 1000 1200 Metapneumovirus-A/B Enterovirus Parainfluenza 1, 2, 3, 4A, 4B Adenovirus Influenza A, B,C RSV A/B 2% 4% 3% 19% 33% 39% Metapneumovir us-A/B Enterovirus Parainfluenza 1,
2, 3, 4A, 4B Adenovirus Influenza A, B,C RSV A/B N° Positivi 30 75 50 345 600 700 N° Esaminati 80 200 100 500 1050 970