LIMITI DEGLI ESPERIMENTI IN VITRO

Mentre gli esperimenti in vitro possono aiutare a risolvere alcuni problemi di modelli FE, si dovrebbe anche essere consapevoli dei limiti delle misure sperimentali. Prima di tutto, gli esperimenti in vitro sono lunghi e richiedono trasduttori e datalogger costosi per misurare grandezze fisiche quali deformazione / spostamento / forza (Figura 2). Inoltre, la misura sperimentale è influenzata sia errori casuali e sistematici [58].

Errori sperimentali: errore sistematico

L’errore sistematico può essere indotta da una serie di fattori:

Preparazione / utilizzo dei trasduttori: in molti casi vengono utilizzati trasduttori sofisticati (ad esempio estensimetri). Una preparazione scadente può causare letture estremamente inaccurate [59-61].

Perturbazione indotta dai sistemi di misura: questo è un principio noto che si applica a qualsiasi campo (vedi il principio di indeterminazione di Heisenberg). In questo caso, quando un sensore di deformazione è applicato ad un osso, ne rinforza la superficie riducendone lo stato di sollecitazione. Ciò comporta una sottostima sistematica della effettiva deformazione. È stato dimostrato che in materiali relativamente cedevoli come il tessuto osseo, tale perturbazione indotta da estensimetri [62-64] o rivestimenti fotoelastici [65, 66] può arrivare al 10-20%.

Sistemi di riferimento anatomici ambigui o mal definiti: un sistema di riferimento è necessario per consentire l’allineamento e il posizionamento dei carichi consistente rispetto

ai campioni anatomici [67]. Poiché tali sistemi di riferimento si basano spesso sull’identificazione soggettiva di punti di riferimento ossei, diversi operatori realizzeranno diverso allineamento dei campioni. Di conseguenza, la direzione del carico applicato non è riproducibile.

Scarsa informazione circa i carichi in vivo: Nella maggior parte dei casi, nelle simulazioni in vitro devono basarsi su informazioni parziali, sulla base di un numero limitato di soggetti, e spesso con grosse semplificazioni [11]. Solo di recente, e solo per un numero limitato di regioni anatomiche, sono stati misurate in vivo le forze durante delle attività fisiologiche(ad esempio: [68-70]).

Configurazione di carico mal progettata: in alcuni casi il sistema di carico è progettato in modo tale da non consentire il controllo del carico applicato. Un esempio è quello di vincoli iperstatici (spesso presenti nella letteratura biomeccanica), dove componenti di carico aggiuntive vengono generati all’interno del sistema di carico [71].

Errori sperimentali: errore casuale

L’errore casuale (rumore) è di natura diversa. Esso può essere indotto da:

Rumore di misura: tutti i sistemi di misura, compresi quelli meccanici, sono affetti da

“rumore”, tra cui le vibrazioni meccaniche, interferenze elettromagnetiche, ecc [72, 73]. Questo è particolarmente vero per la misura di spostamento e deformazione tramite tecniche di correlazione di immagini digitali recentemente sviluppate (DIC) [74].

Incertezza nella posa dei provini: il vincolo, e l’applicazione dei carichi ai segmenti

ossei può essere difficile a causa della geometria irregolare. Il risultato è una variabilità tra le ripetizioni della prova o tra i campioni [11, 75].

Incertezza nel posizionamento e allineamento dei trasduttori: se un trasduttore è

malposizionato/disallineato in modo casuale, la lettura è affetta da un errore imprevedibile [13, 75, 76].

Scarsa ripetibilità dei carichi applicati: nella maggior parte dei casi vengono

utilizzate macchine di prova materiali o simulatori dedicati. In tutti questi casi, attuatori, dispositivi di carico e sistemi di controllo inevitabilmente introducono qualche errore casuale [73, 75].

Costo degli esperimenti in vitro

L’aggiunta di qualsiasi nuovo parametro misurato, o la replica di misura di grandezze fisiche in altre punti di misura è associato con la necessità di utilizzare più trasduttori, insieme a data-logger più potenti. L’aumento del numero di trasduttori è anche associato ad un aumentato complessità (e possibili errori) della configurazione di prova. Inoltre, se un esperimento in vitro deve essere eseguita ripetutamente in condizioni simili (ad esempio per studiare diversi dispositivi impiantabili, diverse configurazioni di carico, condizioni di interfaccia, etc.), aumenta quasi proporzionalmente il costo sperimentale e lo sforzo necessario replicare. Pertanto, gli esperimenti in vitro non sono il miglior strumento per l’esecuzione di studi comparativi su un gran numero di condizioni, o per analisi di sensibilità per esplorare un molteplici scenari.

Disponibilità di provini di tessuto per prove in vitro

La disponibilità di campioni di tessuto umano è limitata, sia per motivi pratici, che per motivi etici. Per queste ragioni, in molti casi, la dimensione campionaria degli esperimenti

in vitro è statisticamente sottodimensionata: in pochissimi si usano più di 10 provini,

mentre in molti casi il campione è limitato ad un singolo esemplare d’osso [4] . Questo impedisce di trarre conclusioni robuste da un punto di vista statistico, a meno che l’effetto da rilevare non sia talmente pronunciato da poter essere rilevato statisticamente anche con una piccola numerosità del campione [54]. Anche la conservazione dei tessuti pone seri problemi. Infatti, è stato dimostrato che sia imbalsamazione e il congelamento può alterare significativamente le proprietà meccaniche del tessuto, se non si usano specifiche procedure [77-80].

Linee guida per progettare e migliorare un setup in vitro

Anche se questo aspetto è a volte poco considerato, anche gli esperimenti in vitro sono solo i modelli della manifestazione fisica sotto indagine. Pertanto, la somiglianza di un esperimento in vitro all’evento fisico in esame non può essere data per scontata. Tale somiglianza dovrebbe essere valutata confrontando l’esperimento in vitro contro alcune prove più dirette del evento fisico: nel caso di prova di osso, il dato di riferimento potrebbe essere ad esempio uno studio clinico sulle fratture ossee, o o la misurazione in vivo della cinematica e/o dei carichi in gioco.

Gli esperimenti in vitro dovrebbero essere progettati come un compromesso tra il desiderio di rendere di replicare le condizioni fisiologiche il più strettamente possibile includendo molti dettagli complessi, e la necessità di controllare con precisione dell’esperimento rendendolo più semplice possibile [81]. Quando si progetta un esperimento si deve tenere a mente che l’esperimento, come qualsiasi altro modello, è in grado di catturare solo alcuni dettagli di una realtà che è molto più complessa. Pertanto, gli esperimenti in vitro devono essere progettati in funzione di uno specifico quesito scientifico. I dettagli che non sono rilevanti per tale quesito devono essere omessi, in quanto ridurrebbero solo il controllo globale che abbiamo sull’esperimento [12]. In altre parole, citando Albert Einstein: “Make things as simple as possible, but not simpler” (dobbiamo rendere le cose più semplici possibile, ma non più semplici).

Come pre-requisito, l’affidabilità di esperimenti in vitro deve essere valutata, in modo da stimare l’incertezza per ogni grandezza misurata. Misurazioni ripetute sullo stesso campione sono cruciali per valutare la ripetibilità di misura intrinseca. Allo stesso tempo, ripetizioni per provini diversi sono necessarie per valutare la variabilità inter-provino [12, 58]. Un utile supporto può essere fornito da modelli FE per individuare e ridurre le fonti di errore sperimentale in modo da garantire che un esperimento in vitro fornisca risultati sufficientemente precisi per essere utilizzati in applicazioni clinicamente rilevanti, o per supportare modelli FE [12].

Figura 3 – Schema a blocchi che mostra come gli esperimenti in vitro sono in grado di supportare i modelli FE. Due vie sono possibili: l’identificazione dei parametri del modello, e la

validazione delle previsioni del modello. (Copyright consorzio VPH-OP; riprodotto con permesso).

4. IL RUOLO DEGLI ESPERIMENTI IN VITRO NEL MIGLIORARE I MODELLI