Materiali didattici destinati a studenti di scuole secondarie

Numerazione di muffe negli alimenti Introduzione

Le muffe, microrganismi largamente diffusi nell’ambiente naturale, si differenziano dai batteri per la loro struttura più complessa e le maggiori dimensioni. Alcuni miceti saprofiti (muffe e lieviti) possono contaminare, durante la conservazione, gli alimenti, trovandovi un terreno adatto alla loro crescita, in quanto ricco di sostanze nutritive. Alcune muffe producono metaboliti, le micotossine, capaci di causare malattie croniche, da alimenti, nell’uomo e negli animali. Numerosi ricercatori in Italia e nel mondo si sono quindi dedicati ad approfondire le conoscenze sul ruolo dei miceti nella contaminazione di alimenti

Di seguito viene descritta una semplice tecnica per l’isolamento e il conteggio delle colonie di muffa

Materiali:

- piastre di Petri con terreno di coltura (forniscono gli elementi/costituenti necessari per la crescita cellulare): agar, sostanza gelatinosa ricavata da alghe marine, arricchita con zuccheri, sali, ecc., e contenente cloramfenicolo (inibisce lo sviluppo di batteri). Il terreno utilizzato è il Malt Extract Agar oppure il Rose Bengal Agar - soluzione fisiologica (9 g. di NaCl in 1000 ml di acqua distillata)

- busta sterile per omogeneizzare

- provette con 9 ml di soluzione fisiologica per preparare le diluizioni - pipette, provette, scatoline a gomito monouso

- parafilm

Protocollo:

a) preparazione del campione pesare 10 g del campione di formaggio contaminato in una busta sterile, scioglierlo aggiungendo 90 ml di soluzione fisiologica mescolando. Da questa diluizione 10-1_{, detta toto, preparare le diluizioni decimali} scalari fino a 10-5_;

b) prelevare 0,1 ml dal toto e inoculare una coppia di piastre di Petri precedentemente allestite con terreno agarizzato;

c) ripetere per ciascuna diluizione il punto b): due piastre per ciascuna diluizione; d) incubare le piastre capovolte per 3-5 gg a temperatura ambiente;

e) dopo 3 giorni di incubazione segnare sulla superficie esterna delle piastre le colonie (piccole aree circolari nel caso delle muffe) presenti, ripetere di nuovo dopo 5 giorni;

f) prendere in considerazione una coppia di piastre inseminate con la stessa quantità e contenenti tra le 15 e le 150 colonie. Se risulta difficile individuare colonie ben isolate, ritenere valide quelle rilevate dopo 3 giorni di incubazione;

g) calcolare le unità formanti colonie di muffe (u.f.c.) per grammo di campione: u.f.c./g = n. colonie Ia_{piastra + numero colonie II}a_{piastra x 1}

2 fattore diluizione

Allegato 2 - Materiali didattici destinati a studenti di scuole secondarie

La carica microbica sulle mani Introduzione (tratta da http://www.washup.org)

Negli Stati Uniti, una recente indagine ha rilevato che solo il 68% dei cittadini si lava le mani dopo aver utilizzato i gabinetti pubblici, a fronte del 95% che, intervistato, asseriva di farlo. Sostanzialmente simile è la situazione in Europa. Tutto ciò nonostante sia universalmente riconosciuta l’utilità del lavarsi le mani per la prevenzione delle malattie infettive. Noi infatti trasportiamo sulle nostre mani milioni di microrganismi, la maggior parte dei quali sono innocui. Possiamo tuttavia raccoglierne, dagli innumerevoli oggetti con i quali veniamo a contatto ogni giorno, di nocivi, e contagiare noi stessi e gli altri. Strofinando le mani nel lavarle, si allenta l’adesione di microrganismi e particelle di sporcizia che inglobate dal sapone l’acqua corrente porta via. Di seguito viene descritto un metodo per valutare la carica microbica (in maggioranza batteri, ma anche lieviti e muffe) sulle mani.

Materiali:

- terreno di coltura (fornisce gli elementi/costituenti necessari per la crescita cellulare): agar, sostanza gelatinosa ricavata da alghe marine. Il terreno utilizzato è il Plate Count Agar;

- soluzione fisiologica (9 g di NaCl in 1000 ml di acqua distillata); - provette con 9 ml di soluzione fisiologica per preparare le diluizioni; - piastre di Petri

- pipette, provette, scatoline a gomito monouso - parafilm

Protocollo:

a) lavare le mani senza sapone per 20 secondi;

b) raccogliere una parte dell’acqua (circa 10 ml), detta toto, in una piastra di Petri sterile;

c) dal toto, preparare in scala 1:10 le diluizioni decimali successive fino a 10-6_;

d) prelevare 0,1ml dal toto e inoculare una coppia di piastre di Petri precedentemente allestite con terreno solido;

e) ripetere per ciascuna diluizione il punto d): due piastre per ciascuna diluizione; f) incubare le piastre capovolte per 72 ore a temperatura ambiente;

g) dopo l’incubazione segnare sulla superficie esterna delle piastre le colonie e prendere in considerazione la coppia di piastre, inseminata con la stessa quantità, e contenente tra le 30 e le 300 colonie batteriche;

h) esprimere la carica microbica attraverso il calcolo delle unità formanti colonie (u.f.c.)/ml

u.f.c./ml = n. colonie Ia_{piastra + numero colonie II}a_{piastra x 1}

1 2 fattore diluizione

ripetere i punti a,b, c, d, e, f, g, h, questa volta lavando le mani con sapone in modo appropriato

Allegato 3 - Materiali didattici destinati a studenti di scuole secondarie

Controllo delle superfici Materiali:

- tamponi con puntale in fibra sintetica o cotone; - pipette, spatoline a gomito;

- piastre di Petri con terreno di coltura (fornisce gli elementi/costituenti necessari per la crescita cellulare): agar, sostanza gelatinosa ricavata da alghe mari- ne. Il terreno utilizzato è il Plate Count Agar per la carica batterica totale;

- parafilm per sigillare le piastre; - sacchetto sterile;

- soluzione fisiologica (9 g di NaCl in 1000 ml di acqua distillata); - provette con soluzione fisiologica per preparare le diluizioni.

Protocollo:

a) delimitare una superficie di 100 cm2_{(cm 10 x cm 10);}

b) strofinare il tampone sulla superficie in esame seguendo le tre direzioni: orizzon- tale, verticale e obliqua;

c) porre il tampone in un sacchetto sterile con 90 ml di soluzione fisiologica (dil. 10-1_);

d) preparare in scala 1:10 le diluizioni decimali successive fino a 10-4_;

e) prelevare 0,1 ml da ciascuna diluizione e inoculare una coppia di piastre prece- dentemente allestite con terreno solido (inseminazione);

f) lasciare le piastre (incubazione) a temperatura ambiente per 3 gg;

g) dopo l’incubazione, prendere in considerazione una coppia di piastre inseminate con la stessa quantità e contenenti tra le 15 e le 150 colonie batteriche;

h) contare il numero complessivo di colonie batteriche su ciascuna delle due piastre e applicare la stessa formula:

n. colonie Ia_{piastra + numero colonie II}a_{piastra x 1 1}

2 fattore diluizione

Allegato 4 - Materiali didattici destinati a studenti di scuole secondarie

Controllo dell’aria Introduzione

La qualità dell’aria può essere controllata in maniera semplice mediante l’esposizio- ne nell’ambiente di piastre contenenti adatti terreni di coltura che permettono, dopo incubazione, la crescita dei germi. La crescita dei microrganismi fornisce un valore, detto indice microbico dell’aria.

Materiali:

- piastre di Petri con terreno di coltura (fornisce gli elementi/costituenti necessari per la crescita cellulare): agar, sostanza gelatinosa ricavata da alghe marine.

I terreni utilizzati sono Plate Count Agar per la carica batterica totale e Malt Exatract Agar per le muffe e i lieviti

- Parafilm per sigillare le piastre

Protocollo:

a) posizionare in diversi punti della stessa stanza quattro piastre di Petri, per ciascu- no dei due terreni, prive del coperchio;

b) lasciarle esposte per 1 ora;

c) incubare le piastre capovolte secondo il seguente schema:

PCA per la carica batterica totale (CBT) a temperatura ambiente per 3 gg. MEA per le muffe e i lieviti a temperatura ambiente per 5 gg.

d) contare il numero complessivo di colonie su ciascuna delle quattro piastre, per ogni terreno;

e) per ogni terreno di coltura fare la media tra:

n. colonie Iª piastra + n. colonie IIª piastra + n. colonie IIIª piastra + n. colonie IVª piastra

ottenendo così il valore di riferimento detto indice microbico dell’aria.

Per la valutazione delle muffe e dei lieviti è opportuno procedere ad una conferma microscopica.

Nelle piastre destinate alla ricerca delle muffe si distinguono grandi colonie con aspetto lanoso-vellutato o rugoso, sulla cui superficie possono essere presenti delle piccole gocciole di varie dimensioni e colori, per lo più concentrate al centro o a volte distribuite sulle zone periferiche. I lieviti invece sono colonie di colore bianco, compatte, di dimensioni medio-piccole.