Materiali e metodi

I pazienti del presente studio multicentrico sono stati arruolati dal febbraio del 2015 al settembre del 2017 presso la UO di Gastroenterologia Universitaria della AOU Pisana e la UO di Gastroente- rologia della AOU San Martino di Genova. Tutti i pazienti presentavano una MC moderata-severa eleggibile alla terapia biologica, con i seguenti criteri di inclusione:

– Fallimento di almeno un trattamento convenzionale per la MC – Età compresa tra 18 e 70 anni

Per limitare i fattori di confondimento e per rendere più riproducibili i dati di farmacocinetica e immunogenicità di IFX e ADL sono stati esclusi i pazienti con pregressa esposizione a farmaci anti-TNF e in terapia di combinazione con tiopurine o MTX. L’uso di 5-ASA era permesso, a dosaggi stabili. Sono stati altresì esclusi i pazienti con i seguenti criteri:

– Malattia prossimale (L4)

– Malattia principalmente fibrostenosante con sintomi ostruttivi – Precedenti terapie con farmaci anti-TNF

– Patologie extraintestinali con necessità di terapia immunosoppressiva – Resezione intestinale nei precedenti 6 mesi

– Pregresse resezioni intestinali estese o sindrome dell’intestino corto – Ileostomia

– NPT in atto

– Gravidanza nota al momento dell’arruolamento – Storia di neoplasia maligna nei precedenti 5 anni – Malattie demielinizzanti del sistema nervoso centrale – Tubercolosi non trattata

– Positività a HIV o al CD test

3.2.2 Disegno dello studio

I pazienti sono stati stratificati al baseline per fattori demografici (età, sesso, fumo), antropometrici (peso, altezza, BMI) anamnestici (anno di diagnosi di MC, durata di malattia, pregresse resezioni intestinali) e clinici (classificazione di Montreal, eventuali EIM, malattia perianale, fistole non perianali, terapie concomitanti).

Prima dell’inizio della terapia è stato eseguito un appropriato screening pre-biologico, comprendente visita clinica con raccolta dell’anamnesi ed esecuzione dell’esame obiettivo, radio- grafia del torace ed esami di laboratorio secondo le buone pratiche cliniche: Quantiferon, CD test, sierologia per HSV, VZV, CMV, HBV, HCV, HIV, EBV. Il grado di infiammazione e le caratteri- stiche fenotipiche della malattia sono stati valutati mediante emocromo, profilo marziale, VES, PCR, CF, endoscopia con ileoscopia retrograda, entero-RM. L’attività clinica ed endoscopica di malattia è stata espressa tramite l’HBI e il SES-CD rispettivamente.

È stata intrapresa una terapia a base di anti-TNF con le seguenti modalità: IFX (Remicade® o Inflectra®) 5 mg/kg in 250 ml di SF EV alle settimane 0, 2, 6 per l’induzione e 5 mg/kg ogni 8 settimane per il mantenimento oppure ADL (Humira®) 180 mg e 80 mg sc alle settimane 0 e 2 rispettivamente (induzione), e successivamente 40 mg ogni 2 settimane (mantenimento). I pazienti in terapia con IFX sono stati sottoposti a pre-medicazione con 80 mg di metilprednisolone in 100 ml di SF EV e attentamente monitorati per tutta la durata dell’infusione. Per entrambi i farmaci vi è stata la possibilità di ottimizzazione della terapia di mantenimento in caso di mancato controllo

della malattia o LOR, con passaggio al regime di somministrazione mensile e monosettimanale per IFX e ADL rispettivamente.

I pazienti sono stati seguiti con visite cliniche ad ogni somministrazione di IFX e ADL. In tali occasioni sono stati prelevati 12 ml di sangue in provette senza anticoagulante prima della somministrazione del farmaco. Il siero risultante è stato congelato a – 20°C e conservato in sierote- ca per le successive analisi farmacocinetiche. In ogni visita è stata stimata l’attività clinica di malat- tia con il HBI ed è stata presa visione delle indagini di laboratorio effettuate, comprendenti emocro- mo, ferritina, VES, PCR, CF.

La risposta clinica primaria alla terapia anti-TNF è stata definita come un HBI < 5 alla setti- mana 14 o un calo dell’HBI ≥ 3 punti rispetto al valore basale. I pazienti con HBI < 5 a un anno sono stati considerati in RC. Le riacutizzazioni (LOR) sono state definite come un HBI ≥ 5 per almeno 2 settimane consecutive. L’attività di malattia è stata descritta in termini clinico-biochimici calcolando l’HBI e misurando i livelli di PCR e CF alle settimane 14, 22 e 54 (a seconda dello specifico farmaco). Sono stati considerati normali valori di PCR < 0.5 mg/dl e CF < 50 μg/ml vs 5.12 μg/ml /g di feci.

Una colonscopia con ileoscopia retrograda ed eventuali biopsie è stata ripetuta a circa un anno dall’inizio della terapia o in occasione di eventuali LOR, come da buona pratica clinica. Gli operatori che hanno eseguito le colonscopie non erano a conoscenza dei dati di TDM dei pazienti. Per valutare l’attività endoscopica di malattia è stato usato il SES-CD. La risposta endoscopica alla terapia è stata definita come un calo di almeno il 30% di SES-CD a un anno rispetto al valore basa- le. Il MH è stato definito come assenza di qualsiasi ulcerazione mucosa rilevabile all’endoscopia. La deep remission è stata definita come RC + SES-CD ≤ 2.

I TL di IFX e ADL sono stati determinati sui campioni di siero corrispondenti alle settimane 14, 22 e 54 tramite i kit commercialmente disponibili Promonitor®-ADL e Promonitor®-IFX (Progenika Biopharma – a Grifols company, Derio - Bizkaia - Spain), seguendo le istruzioni del produttore. Tali tests consistono in ELISA sandwich a 96 micropozzetti pre-rivestiti da anticorpi monoclonali umani anti-IFX o anti-ADL e permettono di quantificare le frazioni libere circolanti di farmaco anti-TNF con valori soglia di 0,024 µg/ml per ADL e 0,035 µg/ml per IFX. Anche se potrebbero rilevare i farmaci legati al TNF, si tratta di una frazione marginale, dal momento che la concentrazione di TNF circolante rientra nell'intervallo di picogrammi per millilitro (pg/ml), tre ordini di grandezza al di sotto delle concentrazioni terapeutiche di ADL e IFX (fra ng/ml e µg/ml). Invece i farmaci legati agli ADA non vengono rilevati. 100 μg/ml vs 5.12 μg/ml l di siero dei pazienti, preventivamen - te diluiti in un assay buffer sia 1:10 che 1:200 per un controllo di qualità interno, sono stati inseriti nei pozzetti separatamente rispetto ai controlli positivi e negativi e ai calibratori prediluiti. Dopo un periodo di incubazione di 60’ a temperatura ambiente per permettere il legame tra il farmaco e l’anticorpo adeso al substrato, un lavaggio ripetuto con apposito tampone (3 lavaggi con 200 μg/ml vs 5.12 μg/ml l di un apposito tampone) ha asportato i campioni non legati. L’aggiunta di 100 μg/ml vs 5.12 μg/ml l di soluzione conte- nente un secondo anticorpo monoclonale anti-IFX o anti-ADL coniugato con la perossidasi del

rafano è stata seguita da un’ulteriore fase di incubazione di 60’ e di lavaggio che ha rimosso l’anticorpo coniugato in eccesso. Successivamente sono stati aggiunti 50 μg/ml vs 5.12 μg/ml l di substrato cromogeno (tetrametilbenzidina) a ciascun pozzetto e, dopo 15’ (per IFX) o 30’ (per ADL) di incubazione al buio, 50 μg/ml vs 5.12 μg/ml l di reagente STOP per bloccare la reazione colorimetrica. Infine tramite spettrofotome- tro con lunghezza d’onda di riferimento 620 nm è stata misurata l’assorbanza a 450nm di ciascun pozzetto, che risulta proporzionale alla concentrazione di farmaco nel siero del paziente. La densità ottica dei campioni è stata interpolata nella curva di calibrazione inclusa in duplicato nell’analisi e la risultante concentrazione di farmaco, ottenuta dall’assorbanza mediante apposito software, è stata moltiplicata per 10 e 200 a seconda della diluizione. Per il calcolo della concentrazione di farmaco nei campioni validi è stato usato il valore corrispondente alla diluizione 1:200. Sono stati considerati negativi i risultati inferiori ai valori soglia indicati dal produttore, mentre i valori supe- riori alla curva di calibrazione sono stati riportati come 12 µg/ml per ADL o 14.4 µg/ml per IFX.

3.2.3 Analisi statistica dei dati

Le variabili continue sono state espresse in termini di media e deviazione standard (SD); le variabi- li categoriche come percentuale. Per comparare le variabili categoriche è stato usato il test del X² con la correzione di Yates per la continuità o il test esatto di Fisher in caso di celle contenenti < 5 elementi nelle tabelle di contingenza. Per confrontare le distribuzioni di variabili continue (come i TL dei farmaci) in funzione di variabili categoriche (come il MH) è stato impiegato il t-test a campioni indipendenti. Per comparare le variabili continue è stato calcolato il coefficiente di corre - lazione non parametrico Rho di Spearman (rs). Per stabilire valori soglia ottimali dei TL e definirne sensibilità e specificità nel predire gli endpoints terapeutici sono state generate e analizzate delle curve ROC (Receiving Operating Characteristic). L’analisi statistica è stata condotta mediante software IBM SPSS Statistics 22 e sono stati considerati statisticamente significativi valori di P < 0.050.