Meccanismo d’azione: l’exon skipping

Non tutte le delezioni a livello del gene di DMD portano in una mutazione out-of-frame: alcune portano a mutazioni in-frame, generando varianti di mRNA capaci di produrre una versione funzionale, sebbene troncata, di distrofina. Una mutazione out-of-frame si verifica quando dopo l’introduzione o la delezione di un numero di nucleotidi che non sia 3 o un multiplo di 3, tutto il frammento di lettura viene shiftato e le triplette perdono la sequenza originaria, portando a inserimento di nucleotidi completamente diversi da quelli dovuti, con risultato la formazione di una proteina anomala e non funzionante. Una mutazione in-frame invece può essere meno grave, in quanto il numero di nucleotidi inseriti o deleti è tre o un multiplo di tre, e quello che succede nella fase finale della traduzione è che la nuova proteina avrà qualche amminoacido in più o in meno, ma il resto degli amminoacidi saranno quelli previsti nella sua sequenza normale. Questo tipo di delezione ad esempio avviene in pazienti con la distrofia muscolare di Becker (BMD), una forma più lieve di distrofinopatia in confronto alla DMD.48 _{La differenza genetica tra la DMD e la BMD presenta}

una considerazione interessante: la natura della delezione determina la severità del disordine. Questo ha portato a capire che fare una delezione meno dannosa trasformando una mutazione da

out-of –frame in una mutazione in-frame dovrebbe alterare il fenotipo della DMD in quello meno

severo delle BMD.

È con questo principio che l’exon skipping e stata sviluppata come una strategia terapeutica nella DMD. Secondo questo approccio, il frammento di lettura di un gene durante la traduzione viene ripristinato utilizzando analoghi di acidi nucleici sintetici chiamati oligonucleotidi antisenso (AOs) in grado di interagire con lo splicing del mRNA pre-messaggero,49 _{(Figura 7).}

47 Figura 7: Eteplirsen e meccanismo d’azione45

In genere gli oligonucleotidi antisenso sono brevi molecole a singolo filamento di DNA (e in alcuni casi di RNA) complementari ad una determinata sequenza. La sequenza a cui si legano è solitamente una molecola di mRNA che, legata da un AO specifico, non è più in grado di essere tradotta. La struttura di eteplirsen è costruita sulla base di questo approccio, ma con alcune differenze che verranno dettagliate più avanti.

In questa figura vengono illustrati tre casi diversi:45

 Nella prima colonna si tratta di un paziente sano senza mutazioni a livello del gene DMD dove l’mRNA prematuro si trasforma senza ostacoli nell’mRNA che a sua volta porterà alla produzione di distrofina completamente funzionante.

 Nella terza colonna viene illustrato il meccanismo d’azione di eteplirsen (la barra verde), il quale riconosce in modo specifico l’esone 51 nel gene della DMD. Una volta legatosi, esso induce il meccanismo di splicing di saltare l’esone 51 dalla trascrizione dell’mRNA maturo. Questo ripristina il frammento di lettura del gene DMD, permettendo la traduzione con successo di una proteina più corta ma funzionante.

 Nella seconda colonna della figura viene rappresentato il caso dove eteplirsen viene impiegato per trattare un paziente con DMD che presenta una delezione tra gli esoni 49 e 50. Essendo però eteplirsen specifico per la sequenza dell’esone 51, non funziona negli esoni precedenti quindi la mutazione li presente vi rimane e questo porta ad un frameshift

48

out-of-frame, il che introduce un codone di stop prematuro e di conseguenza non si ha produzione di distrofina.

Gli oligonucleotidi antisenso sono impiegati per legare sequenze complementari target nel mRNA prematuro, inducendo quindi lo splicing ad escludere un esone o più esoni dal trascritto finale. Il potenziale terapeutico di questo metodo è stato per prima dimostrato nel 1993, dove il corretto splicing del gene della β-globina umana è stato rigenerato con successo in vitro tramite l’utilizzo di un oligonucleotide nonsense 2’O-metil RNA.50 _{Da allora, questa strategia si è ampliata ed oggi}

vengono utilizzate una vasta gamma di sequenze AO per il trattamento di vari disordini.49

Eteplirsen è un oligonucleotide antisenso (AO) del tipo oligomero morfolinico fosforodiammidato,(PMO)51_,

composto da un numero determinato di nucleotidi. A differenza del normale RNA o DNA, le basi del PMO sono attaccate a una porzione morfolinica, e le subunità sono collegate tramite legami fosforodiammidati che hanno carica neutra a livello del pH fisiologico.52 _Eteplirsen

ibridizza all’esone 51 del gene della DMD e causa lo skipping di una porzione di esso durante lo splicing. Questo corregge il frammento di lettura della traduzione portando dunque alla formazione di distrofina più corta ma funzionale.

Un trattamento simile per la DMD, drisapersen (BioMarin, San Rafael, CA, USA), del quale si è parlato nel capitolo 3, è anch’esso una sostanza basata sulla struttura degli oligonicleotidi antisenso con lo stesso meccanismo d’azione. Esso differisce però da eteplirsen in quanto è un tipo di AO 2’O-metil fosforotioato, il quale è caricato negativamente. La FDA ha rifiutato drisapersen nei primi mesi del 2016 a causa di problemi di sicurezza associati all’utilizzo di tale medicinale, e perché le prove della sua utilità clinica non erano sufficienti.45

49

Vengono riportate anche le strutture del DNA e dell’RNA per confrontare le differenze strutturali tra loro e i composti di sintesi menzionati in precedenza. Si nota che eteplirsen è una molecola neutra, mentre il 2’O- MePS è caricato negativamente. Questa proprietà si pensa essere associata alla maggiore stabilità degli PMO e alla loro sicurezza come agenti terapeutici.

Da eteplirsen traggono beneficio pazienti affetti da DMD con delezioni che riguardano l’esone 51.Questo riguarda all’incirca il 20,5% dei pazienti con DMD con mutazioni di tipo delezione, ovvero il 14% di tutti i pazienti con DMD.53 _{Questo è il gruppo più grande di pazienti a cui si può}

applicare la terapia con lo skipping di un singolo esone, rendendo l’esone 51 un target terapeutico ragionevole. Inoltre, l’efficacia in vivo dello skipping dell’esone 51 nel gene del DMD utilizzando i PMO è stata dimostrata in modelli di topi mdx52,54 _{confermando la sua efficacia come target}

farmacologico.