Problemi e sfide correlati alla tipologia dei studi clinic

Eteplirsen sta affrontando due grandi problemi nel confermare la sua efficacia come un trattamento nella DMD:

 Il primo è la sua apparente mancata efficacia.

 Il secondo risiede nel disegno del trial clinico, in particolare per il trial NCT01396239/NCT01540409.

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La performance non soddisfacente di eteplirsen nel trial NCT01396239/NCT01540409 potrebbe essere attribuita in parte alla sua struttura chimica. Una delle sfide principali nell’utilizzare i PMO come un trattamento farmacologico è quella di incrementare l’assorbimento a livello del tessuto target, in quanto i PMO subiscono una rapida clearance a causa della loro natura come sostanze neutre.

L’assorbimento di eteplirsen, senza alterare la struttura chimica, potrebbe essere migliorato aumentando la dose e la frequenza di somministrazione. Risultati di efficacia importanti nello studio NCT01396239/NCT01540409 si sono ottenuti principalmente con dati combinati da entrambi i gruppi trattati con eteplirsen in dosaggio rispettivamente 30mg/kg a settimana e 50mg/kg a settimana (Tabella5), quindi l’effetto di una dose più alta non può essere stabilito chiaramente in questo caso. La frequenza di dose non era studiata in nessuno dei trial clinici. Come ha suggerito anche la FDA,47 _{potrebbe rivelarsi utile osservare come l’aumento di entrambi questi}

due parametri potrebbe migliorare l’efficacia.

Inoltre, l’assorbimento potrebbe essere migliorato somministrando l’eteplirsen con degli zuccheri esosi, cioè glucidi monosaccaridi con formula generale C₆H₁₂O₆. Diverse ricerche hanno dimostrato che la somministrazione di PMO in una formulazione contenente glucosio e fruttosio è otto volte più efficace a migliorare la produzione di distrofina tramite l’exon skipping rispetto ai PMO somministrati in soluzione salina.

Un’altra domanda fondamentale è se la sequenza antisenso utilizzata per l’eteplirsen sia la scelta migliore. L’efficacia dell’exon skipping in diverse posizioni target di un unico esone varia più di 20 volte.62 _{Sebbene sono stati fatti vari screening per identificare la posizione target migliore per}

lo skipping dell’esone 51, essi si sono basati su metodiche di PCR non quantitativa, utilizzando cellule muscolari primarie non immortalizzate prelevate da muscolo affetto da DMD, le quali possono produrre segnali di background molto elevati. Attualmente modelli cellulari di mioblasti con DMD, immortalizzati dall’introduzione della subunità della telomerasi catalitica (hTERT) e dal CDK463_{, possono proliferare e differenziarsi abbastanza bene da poter produrre una grande}

quantità di distrofina dopo l’exon skipping, che può essere quantificata dal test WesternBlot.62

L’ottimizzazione della sequenza utilizzando questo modello cellulare potrebbe potenzialmente migliorare l’efficacia dell’exon skipping.

Sempre riguardo a questo studio, la distrofina prodotta da delezioni in-frame sul gene del DMD, che iniziano e finiscono nell’esone 51, risulta essere associata più con la DMD che con la BMD.64 _{In quanto tale, un'altra possibile causa della scarsa efficacia osservata nell’eteplirsen}

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era tanto funzionale quanto si era sperato all’inizio. Ad ogni modo, siccome la funzionalità delle

varianti di distrofina troncata come risultato dell’exon skipping non sono state ancora studiate approfonditamente, questa affermazione rimane, nella migliore delle ipotesi, solo una possibilità.

Come menzionato in precedenza, un altro problema è il disegno del trial clinico. NCT01396239/NCT01540409 sta affrontando principalmente 4 problemi:

 Assenza di buoni controlli  Eterogeneità dei campioni  Numero inadeguato di campioni

 Utilizzo di una selezione limitata di misure dei risultati.

Mentre l’uso dei controlli storici è in qualche modo giustificato nel NCT01540409 – in cui chi indaga seleziona i controlli più compatibili – rimangono dei fattori esterni che possono rendere difficili le conclusioni sull’efficacia. Ad esempio, non tutti i pazienti utilizzati per il controllo storico sembrano

soddisfare i criteri di inclusione/esclusione per NCT01396239/NCT01540409 (Tabella4). I n quanto

tale, i valori di controllo utilizzati per valutare il trattamento potrebbero non essere completamente accurati.45

L’eterogeneità della coorte è un altro fattore che complica i risultati. I pazienti che hanno

partecipato nel trial NCT01396239/NCT01540409 avevano età diverse, diversi tipi di mutazioni e caratteristiche di base differenti, come ad esempio il risultato del 6MWT.56 _{Data la storia naturale}

della DMD, l’età gioca un ruolo critico nella progressione della malattia65 _{e potrebbe influenzare}

l’entità della risposta al trattamento fra pazienti diversi. Genotipi diversi, a seconda del tipo di mutazione a livello del gene DMD, portano a fenotipi di DMD diversi.66 _{Per quanto riguarda la}

terapia già in atto con corticosteroidi, non sono stati pubblicati i dati. Tuttavia, è probabile che questa variava tra i pazienti e potrebbero aver confuso i risultati sull’efficacia.

La sfida, quindi, sarebbe quella di progettare uno studio in grado di gestire la naturale variabilità fenotipica associata con la DMD, costruendo un gruppo il più omogeneo possibile con i partecipanti disponibili. Tra l’altro, questo dovrebbe aiutare a impostare una linea di base rappresentativa e migliorare l’affidabilità dei test di efficacia.

Un altro problema è il basso numero di campioni utilizzato nel NCT01396239/NCT01540409. A causa della variabilità tra i pazienti e la difficoltà di ricavare risultati statisticamente utili con un numero limitato di pazienti, l’efficacia di eteplirsen potrebbe non essere debitamente rappresentata nello studio. Mentre lo studio successivo, NCT02255552, ha affrontato questo problema pianificando di arruolare 160 pazienti (Tabella3), per incrementare ulteriormente

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il numero dei campioni si possono adottare anche altri criteri. Un modo sarebbe quello di includere pazienti non ambulatoriali nei trial, in quanto la maggior parte dei pazienti con la DMD non sono ambulatoriali.67 _{Questo ha il vantaggio di impedire di “perdere” pazienti a causa della perdita della}

mobilità, offrire l’opportunità a pazienti non ambulatoriali di partecipare ai trial clinici, e facilitare la creazione di gruppi più omogenei.67 _{Ciò tuttavia, comporterebbe lo sviluppo e/o l’utilizzo di}

misure di risultato appropriati per la valutazione dell’efficacia.

Per quanto riguarda le metodiche impiegate a misurare i risultati, non tutte quelle utilizzare nel NCT01396239/NCT01540409 sono sufficienti a dimostrare l’efficacia, in particolare per quanto riguarda la funzione muscolare. Sebbene il 6MWT sia un endpoint standard per valutare l’utilità clinica delle terapie per la DMD68_{, esso è limitato in quanto si può applicare solo a pazienti}

ambulatoriali, e in più ha dimostrato essere dipendente dalla motivazione e l’incentivazione che viene fatta al paziente da parte del team che lo segue.69 _{Viene suggerito quindi di applicare altri}

metodi per valutare la funzione muscolare, come ad esempio:

 La scala della Performance degli Arti Superiori (Performance of Upper Limb scale) la quale valuta la capacità dei pazienti ad eseguire 22 compiti giornalieri diversi utilizzando i loro muscoli superiori

 La miometria, che valuta in modo quantitativo la forza muscolare, come ad esempio la forza di presa della mano (handgrip test) e l’estensione del ginocchio, tramite una vasta gamma di test.70

Questi test non solo sono più coinvolgenti perché includono anche i pazienti non ambulatoriali, ma possono anche determinare come il trattamento influenza gruppi di muscoli specifici.

Infine, c’è il problema della riproducibilità e affidabilità dei metodi utilizzati per l’endpoint biochimico nel NCT01396239/NCT01540409. I test immunoistochimico (IHC) e di WesternBlot (WB) sono procedure standard utilizzate per quantificare l’effetto del trattamento sull’espressione della distrofina. Tuttavia, diverse ricerche svolte dal FDA hanno dimostrato che le metodiche utilizzare in queste tecniche sono discutibili.47 _{Di conseguenza, qualsiasi correlazione tra i resultati ottenuti con}

questi test e gli effetti reali riguardo la funzione muscolare non può essere affidabile. Dopo essere stati oggetto di rigorosa valutazione, questi metodi sono stati migliorati e convalidati secondo gli standard prestabiliti dalla FDA, per essere poi utilizzati nello studio NCT022555552. Ciononostante, sarebbe di aiuto utilizzare un ulteriore test, altamente riproducibile, per misurare gli effetti ottenuti. Un esempio è la quantificazione della conversione del tessuto muscolare in tessuto adiposo tramite la risonanza magnetica e la spettroscopia 71_.

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4.3.

Sicurezza e tollerabilità di eteplirsen

La struttura chimica dei PMO presenta alcuni vantaggi in termini di sicurezza, dovuta al fatto che i PMO sono privi di carica. Si pensa che questo renda i PMO altamente incapaci di interagire con proteine come le nucleasi, la cui affinità verso i loro target naturali (DNA, RNA) è altamente dipendente dalla presenza di una carica negativa.52 _{Di conseguenza, i PMO non sono soggetti alla}

degradazione nucleasi-mediata e sono altamente stabili nell’ambiente cellulare. Questa stabilità si aggiunge alla loro sicurezza come terapia, poiché l'incorporazione indesiderata di singole subunità di PMO nel materiale genetico di un paziente è praticamente improbabile.52

Inevitabilmente, questa incapacità di interagire con le proteine rende i PMO incapaci di legare in modo sufficiente e attivare i recettori Toll-like, una classe di recettori responsabili della produzione di una risposta immune innata contro elementi patogeni estrinseci.48 _{Una volta attivati,}

i recettori Toll-like avviano delle cascate di segnalazione che portano a loro volta all’attivazione dei fattori di trascrizione appartenenti alle famiglie del fattore nucleare kappa B(NFϏB), API e IRF. Queste famiglie in modo collettivo stimolano la produzione di citochine pro-infiammatorie e di IFN di tipo I che inducono l’infiammazione.72

Alla sicurezza dei PMO si aggiunge anche il fatto che sono indipendenti dal percorso degradativo delle Ribonucleasi H (RNase H), famiglia di enzimi endonucleasici non sequenza- specifici che catalizzano il clivaggio dell’RNA tramite un meccanismo di idrolisi, in quanto promuove specificità di attività antisense.52 _{Siccome il sistema delle Ribonucleasi H non viene utilizzato, la}

degradazione indesiderata di trascritti non target non può avvenire.