Metodologie di analisi

Tutte le analisi sono state effettuate su tre campioni.

Analisi del suolo

Tutte le analisi sono state condotte seguendo le metodologie ufficiali del supplemento ordinario G.U. n° 248, riportate da Violante (2000).

La determinazione della granulometria è stata effettuata per setacciatura ad umido e sedimentazione alla T di 20 °C impiegando i levigatori di Esenwein secondo i tempi di prelievo previsti dalla classificazione USDA. Il metodo è quello ufficiale n° II.5.

Il suolo è stato classificato secondo il triangolo delle tessiture USDA.

Il pH(H2O) è stato determinato per via potenziometrica, seguendo il metodo ufficiale III.1. La

misurazione è avvenuta con pH-metro: Analytical Control Spa, model 150 potentiometric.

La conducibilità elettrica è data dalla determinazione diretta (strumentale) della conduttività elettrica in estratti acquosi del suolo (rapporto acqua/ suolo 2:1), utilizzando il Metodo Ufficiale IV.1. Il conducimetro utilizzato: Crison Basic 30 (Biscaglia, Spagna).

Il calcare totale è avvenuto per via gas-volumetrica (Metodo Ufficiale n° V.1). Lo strumento di misura utilizzato è il calcimetro di Scheibler.

L’azoto totale è stato determinato dopo mineralizzazione per via umida in acido solforico e catalizzatore (AAVV, 1991) per distillazione secondo il metodo Kjeldhal (Metodo Ufficiale XIV.3). Il procedimento prevede la determinazione della percentuale di azoto passando attraverso la digestione, la distillazione e la titolazione dei campioni. È stato utilizzato il distillatore Foss (modello Kjeltec 2200; Hillerod, Denmark) ed il titolatore Titronic 96 mL (Weilheim, Germania). La sostanza organica totale è stata determinata per calcinazione in muffola alla temperatura massima di 440 °C (loss on ignition), secondo una procedura elaborata da Storer (1984) seguendo il metodo USGA (ASTM D 2974-87).

Analisi morfometriche

Per la misurazione di peso, altezza, larghezza, spessore sono stati utilizzati una bilancia di precisione e un calibro.

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Analisi frutto fresco

Caratteristiche nutraceutiche e capacità antiossidante

Estrazione. 0,5 g di campione sono stati omogeneizzati in 5 mL di metanolo 80% (v:v); la

sospensione, dopo sonicazione a freddo per 30 minuti è stata centrifugata a 10 000 giri per 15 minuti, a 4°C.

L’estratto limpido è stato utilizzato per le analisi di polifenoli, tannini e capacità antiossidante tramite saggio DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazile).

Polifenoli totali. Per la determinazione del contenuto in polifenoli ci siamo avvalsi del metodo

colorimetrico del Folin-Ciocalteau elaborato da Dewanto et al (2002), con alcune modifiche. A 50 µL di estratto sono stati aggiunti 75 µL di H20 e 125 µL del reagente Folin-Ciocalteau. La miscela di

reazione è stata agitata e lasciata riposare per 6 minuti a T ambiente. Poi sono stati aggiunti 1,25 mL di Na2CO3 al 7%. Il campione è lasciato incubare al buio e a temperature ambiente per 90

minuti. Una volta terminato questo tempo, si è proceduto alla lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 760 nm. Il bianco è stato preparato allo stesso modo utilizzando 125 µL iniziali di sola acqua. La retta di taratura è riferita all’acido gallico: y= 0,01146x – 0,1515. La concentrazione in polifenoli è espressa in mg equivalenti acido gallico/ g FW.

Tannini. I tannini sono stati determinati secondo il metodo proposto da Makkar (1996), con

alcune modifiche: 0,5 mL dell’estratto sono diluiti con 0,5 mL H20; a questo sono aggiunti 50 mg

PVPP (polivinilpolipirrolidone), il tutto è mantenuto a 4°C per 15 minuti agitando ogni 5; alla fine del tempo di incubazione la sospensione è centrifugata (3000 g per 10 minuti) e sul surnatante sono determinati i fenoli. I tannini risultano dalla differenza tra la concentrazione dei polifenoli totali determinati sull’estratto tal quale e quella letta dopo la precipitazione dei tannini con PVPP.

DPPH. La capacità antiossidante tramite saggio DPPH è stata determinata secondo un protocollo

basato sul metodo descritto da Brandwilliams et al (1995).

E’ stata preparata una soluzione 3,12x10-5 M di DPPH in metanolo all’80%. A 10 µL di estratto sono stati aggiunti 990 µL di soluzione DPPH. La miscela è stata agitata e per 30 minuti incubata al buio. Il bianco è costituito dalla soluzione DPPH. Una volta terminata l’incubazione si è proceduto alla lettura allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 515 nm per determinare la concentrazione del radicale DPPH rimasto allo stato ossidato. Con i dati ottenuti si determina la percentuale di inibizione calcolata secondo la seguente formula:

87 Il valore ottenuto costituisce la Y nella seguente curva di taratura in equivalenti di trolox.

y= 3,5887x + 0,1412.

I risultati sono espressi in µmol trolox equivalent/ g FW.

Analisi sul secco

Proprietà nutrizionali

Sostanza secca. I frutti freschi sono stati sbucciati e, ridotti in piccoli pezzi, posti in stufa a 65 °C

fino a peso costante secondo il metodo adottato da De Vasconcelos (2007).

Ceneri. Si è proceduto tramite metodo gravimetrico, così come mostrato nelle procedure di analisi

ISS (Baldini, 1996; Gazzetta Ufficiale dell’Unione europea L 54/50 26.2.2009): è avvenuto l’incenerimento di una aliquota del campione alla temperatura di 550 ± 10 °C, fino a completa combustione della sostanza organica e al raggiungimento di una massa costante.

Lipidi grezzi (EE). Ci siamo avvalsi della tecnologia e delle metodologie Ankom Technology inc. (Macedon, NY), in particolare del metodo per l’analisi dei grassi (Ankom, 2009), che fa uso dell’estrattore semi automatico mod. XT10, e dei sacchetti filtranti mod. XT4. Il metodo seguito è quello Soxhlet (metodo ufficiale AOAC, 1990). 0,5 g di campione secco sono stati posti nei filter

bags XF4 appositi per l’estrazione di grassi che una volta termosaldati sono stati essiccati per 3

ore in stufa a 103 ± 2°C, pesati e inseriti nell’estrattore per 60 minuti con etere di petrolio bollente e sotto pressione. Dopodiché i filter bags sono stati prelevati, posti in stufa 103 ± 2°C per 30 minuti e pesati. La differenza tra il peso iniziale e quello finale è costituita dai composti disciolti dall’etere di petrolio.

Fibra. Sono state utilizzate le tecnologie e metodologie proprie della ditta ANKOM per eseguire la

determinazione delle frazioni fibrose (tutte le procedure sono scaricabili dal sito ankom.com). I

filter bags utilizzati sono gli F57, chimicamente inerti e resistenti.

Analisi della Fibra grezza (FG). L’analisi permette di determinare il contenuto in carboidrati

strutturali vegetali (cellulosa, emicellulosa, lignina, pectina, cutina) che costituiscono la fibra grezza, attraverso il metodo Weende, modificato secondo ANKOM Technology, filter bag

technique (G. U, 1994). In particolare 1 g di campione secco è stato posto nel sacchetto filtrante

precedentemente tarato. Una volta chiusi con la termosaldatrice i sacchetti sono stati posti nell’analizzatore per fibra ANKOM 200, dove è stata aggiunta la soluzione acida (2 L di H2SO4

88 dopo eliminazione della soluzione acida si è al risciacquo, per 3 volte con 2 L di acqua bollente. Dopo i risciacqui, sono stati aggiunti 2 L della soluzione basica (NaOH 0,313 N) procedendo, come per la soluzione acida, per 30 minuti. Dopo avere nuovamente risciacquato, i bags sono prelevati e messi in acetone puro per 3-5 minuti. Una volta asciutti all’aria sono stati poi posti in stufa a 103 ± 2°C per una notte, poi pesati. Successivamente i sacchetti posti singolarmente in capsule tarate sono stati inceneriti in muffola a 550 °C.

La fibra grezza, al netto delle ceneri, è quello che rimane di organico dopo questo trattamento che porta alla rimozione di proteine, zuccheri, amido, grassi e porzioni di carboidrati strutturali e lignina.

Costituenti fibrosi (NDF) e solubili (NDS). L’analisi consente di separare i costituenti fibrosi (NDF)

ossia cellulosa, emicellulosa, lignina, pectina, cutina e i costituenti minerali, dal contenuto cellulare solubile (NDS) ossia zuccheri, pectine, acidi organici, sostanze azotate proteiche e non proteiche, lipidi, sali minerali solubili. Il metodo seguito è quello suggerito da Van Soest (1991). All’interno dei filter bags, precedentemente tarati, sono stati posti 0,5 g di campione secco. I

filter bags, termosaldati, sono stati pretrattati, perché contenenti campioni ricchi di amido, con

acetone puro per 10 minuti a temperatura ambiente, asciugati all’aria e introdotti nell’apposito cestello dell’analizzatore per fibra ANKOM 200. All’interno dell’estrattore sono stati aggiunti 2 L di soluzione neutro detergente (ANKOM), 20 g di sodio solfito e 4 mL di α-amilasi (così come fornita da Ankom).

La soluzione è poi portata alla temperatura di 100 °C sotto agitazione per 60 minuti. Terminato questo processo la soluzione è stata scaricata, e sono stati effettuati risciacqui con acqua distillata bollente. Nell’ultimo risciacquo sono stati addizionati 4 mL di α-amilasi. Finito il lavaggio, i sacchetti sono stati immersi in acetone puro per 3-5 minuti, poi essiccati, inizialmente all’aria poi in stufa a 103 ± 2 °C per una notte, raffreddati in essiccatore e pesati. Il contenuto in NDF è dato dal peso residuo.

Analisi del residuo fibroso (ADF). Il residuo fibroso è costituito da cellulosa, lignina, cutina,

eventualmente tannini, pectine e sostanze minerali insolubili è stato valutato attraverso un trattamento idrolitico del campione con una soluzione detergente in ambiente acido. Il metodo seguito è stato quello di Van Soest (1991) così come riportato dal metodo 5 di Ankom (2013). 0,5 g di campione secco sono stati inseriti dentro gli appositi filter bags, già tarati e “marcati”. I filter

bags sono stati posti nell’analizzatore per fibra ANKOM 200. A questo punto sono stati aggiunti 2

89 e, chiuso l’analizzatore, la soluzione è stata portata alla temperatura di 100°C e mantenuta sotto agitazione per 60 minuti. Terminato questo processo la soluzione è stata scaricata e sono stati effettuati risciacqui con acqua distillata bollente. I campioni sono stati rimossi, posti in acetone puro per 3-5 minuti, poi in stufa (103 ± 2°C) e pesati il giorno seguente. L’ADF è ricavata dalla differenza di peso pre- e post-trattamento.

Analisi della Lignina acido detersa (ADL): L’analisi consente la determinazione della lignina grezza

mediante il trattamento dell’ADF con acido solforico al 72%. Dopo aver completato la procedura ADF, gli stessi filter bags sono posti nell’incubatore DAISY, secondo il metodo 8 (Ankom, 2013). Qui sono stati aggiunti 500 mL di H2SO4 al 72 % (v:v), e si è lasciato incubare per circa 3 ore in

blanda agitazione a temperatura ambiente. I campioni sono stati poi lavati con acqua distillata bollente, per rimuovere completamente ogni residuo di acido (per esserne sicuri, si utilizzano cartine tornasole). Successivamente i campioni sono stati immersi in acetone puro per 3-5 minuti. Una volta seccati vengono posti in stufa (102 ± 2°C) per una notte, e pesati. Successivamente gli stessi bags sono stati messi in muffola a 550 °C, poi pesati nuovamente. In tal modo è stato possibile fare i calcoli al netto delle ceneri.

Zuccheri. Gli zuccheri sono stati misurati seguendo i metodi proposti da Yusof et al (2016) e Sotelo

et al. (2014) con alcune modifiche. 50 mg di campione secco sono stati posti in 0,2 mL di metanolo all’80% (v:v), e sonicati a 60 °C per 30 minuti. La soluzione è stata poi centrifugata a 10 000 g per 10 minuti e il surnatante filtrato usando filtri HPLC (0,45 µm). Saccarosio, glucosio e fruttosio sono stati analizzati utilizzando il kit K-SUFRG (Megazyme, Ireland) seguendo il protocollo proposto dalla stessa ditta. Il pellet residuale della soluzione centrifugata è stato usato per individuare il

quantitativo di amido, avvalendoci del kit di Megazyme (K-TSTA). Poiché in presenza di amido

resistente, si è proceduto con l’esempio (c) indicato dal protocollo Megazyme.

Proteine. Le proteine grezze sono state calcolate dopo la determinazione dell’azoto totale

secondo il metodo micro-Kjeldhal (AAVV, 1991; Gazzetta Ufficiale, 1994; Gazzetta Ufficiale, 2009). Il campione digerito, addizionato di NaOH (in eccesso), è stato distillato. L’ammoniaca raccolta in eccesso di acido borico al 4% (p:v) e in presenza degli indicatori rosso di metile e verde di bromocresolo è stata poi titolata con una soluzione standard di HCl O,1 N determinando il tenore di azoto totale. Tale quota è stata poi convertita in protidi grezzi tramite fattore di conversione 5,3, così come riportato dalla letteratura sull’argomento (Neri et al 2010; Pereira- Lorenzo et al 2006; McCarthy, 1988).

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Fosforo. Per la determinazione del fosforo e degli elementi minerali si è utilizzato un campione

mineralizzato per via umida in miscela H2SO4 (5 mL, 96 %, v:v) e H2O2 (6 mL), così come indicato

nelle procedure AAVV (1991). La determinazione della concentrazione in fosforo nelle soluzioni ottenute avviene per via colorimetrica secondo il metodo al blu di molibdeno (Murphy e Riley, 1962), come modificato da Benini et al (2014), utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. Sono state preparate tali soluzioni: ammonio molibdato 4 idrato (NH4)6 Mo7O24 -4H2O 18 g/L e

soluzione acido ascorbico L- 25 g/L. A 800 µL di estratto digerito sono stati aggiunti 7 mL di acqua ultrapura, 390 µL di H2SO4 4 M; poi 400 µL di soluzione ammonio 4 idrato e altrettanti della

soluzione di acido ascorbico. Il tutto è stato posto in bagnomaria a 90 °C, poi fatto raffreddare, e portato a volume di 10 mL. La soluzione è stata diluita 1:100. Il bianco è stato preparato con 7,61 mL di H2O e 580 µL di H2SO4. Successivamente si procede alla lettura della lunghezza d’onda a 650

nm. La retta di taratura è: y= 0,03153x – 0,0459. I risultati sono espressi in mg/kg.

Elementi minerali. La concentrazione dei vari elementi minerali è stata determinata sui campioni

mineralizzati e opportunamente diluiti con acqua ultrapura, utilizzando un lettore di assorbimento atomico Thermo Scientific (ICE 3000 Series, Massachusetts, Stati Uniti) con fiamma aria-acetilene. Gli elementi analizzati sono stati: K, Ca, Mg, Cu, Na, Mn, Zn.

Le curve di taratura sono state determinate con le soluzioni standard note a concentrazioni crescenti dei vari elementi.

Analisi farina

Nella farina abbiamo rilevato: -sostanza secca;

-fenoli, tannini e DPPH; -estratto etereo; -proteina grezza; -carboidrati.

Per tutte le analisi ci siamo avvalsi delle metodologie applicate al frutto di castagna prima illustrate.

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Analisi statistica

Tutte le analisi sono state condotte in triplo. I risultati sono espressi come media ± deviazione standard (DS). L’analisi statistica è stata condotta mediante l’analisi della varianza (ANOVA) a una via. La procedura ANOVA a una via produce un'analisi della varianza per una variabile dipendente quantitativa in base a una singola variabile fattore (indipendente). Lettere diverse corrispondono a differenze statisticamente significative.