MiRNA come biomarcatori diagnostici per il MPM

Ad oggi risulta sempre difficile la differenziazione tra il MPM e gli adenocarcinomi o le metastasi di altre neoplasie e, a causa dell’assenza di marcatori accurati, l’espressione dei miRNA potrebbe essere considerata come un’opzione interessante per ottenere una miglior diagnosi differenziale e ciò ha incoraggiato i ricercatori a studiare nuovi bersagli molecolari, come i miRNA.

Le prime ricerche hanno identificato la famiglia miR-200 come potenziali candidati nel discriminare il MPM da altri tumori che invadono il polmone come l’adenocarcinoma.

Gee et al. (2010) per primi hanno identificato 7 miRNA specifici per il MPM, tra cui miR- 200b, miR-200c, miR-141 e miR-429. Sono potenzialmente utili per la diagnosi differenziale dall’adenocarcinoma, in quanto la sottoregolazione di questi miRNA è caratteristica del MPM e la discriminazione tra i due gruppi per ogni miRNA forniva un valore di AUC superiore a 0,90, rientrando ampiamente nella raccomandazione dell’International Mesothelioma Interest Group che prevede una sensibilità e specificità superiore dell’80% per identificare nuovi biomarcatori. Non si sono rivelati potenzialmente utili, invece, per la distinzione dei vari sottotipi istologici.

74

Successivamente è stato sviluppato un test diagnostico basato sull’espressione di miR- 193a-3p, miR-200c e miR-192. L’espressione dei miRNA è specifica per il tessuto e altamente informativa per identificare l’origine del tumore. MiR-193a-3p era sovraespresso in MPM, mentre miR-200c e miR-192 erano sovraespressi nell’adenocarcinoma polmonare periferico e nei carcinomi che spesso si metastatizzano nella pleura polmonare. La differenziazione tra il MPM ed i carcinomi è stata estremamente difficile in quanto nessun miRNA ha permesso di discriminare i due gruppi, mentre il test che è stato sviluppato con la combinazione di questi miRNA ha raggiunto una sensibilità del 100% ed una specificità del 94% in un set di convalida in cieco di 68 campioni dal polmone e dalla pleura, raggiungendo specificità e sensibilità molto elevate per la diagnosi di MPM (Benjamin et al., 2010).

Un recente studio (Andersen et al., 2014) ha confrontato i profili dei miRNA tissutali nel MPM con i tessuti pleurici non-cancerosi con proliferazioni mesoteliali reattive (RMP) al fine di capire se potevano aiutare nella diagnosi differenziale tra MPM e RMP. Dopo lo screening di 742 miRNA, i ricercatori hanno identificato miR-126, miR-143, miR-145 e miR-652 come i miglior candidati per diagnosticare il MPM, risultando sottoregolati in questa neoplasia. Questi studi sono stati convalidati in una coorte più ampia ed utilizzando questi quattro miRNAs in combinazione, i campioni di tessuto dei pazienti possono essere classificati come MPM o RMP, con una precisione di 0,94, una sensibilità di 0,95, una specificità di 0,93 ed una AUC molto alta di 0,96. Lo studio suggerisce che i miRNA possono fornire nuove opportunità per migliorare l’accuratezza della diagnosi differenziale tra MPM e condizioni pleuriche non tumorali.

Nonostante questi risultati molto promettenti, questi tre studi riportati si basano sull’espressione dei miRNA nel tessuto e, preferibilmente, un test diagnostico dovrebbe misurare i miRNA in campioni acquisiti in modo meno invasivo come sangue, urina o nei versamenti pleurici.

I primi studi che hanno spostato il focus della ricerca dai miRNA cellulari/tissutali a quelli presenti nella circolazione sanguigna, sono stati condotti da Santarelli et al. (2011) e da Tomasetti et al. (2012). Nel primo studio (Santarelli et al., 2011) è stato esaminato il profilo di espressione dei miRNA nei tessuti ed in seguito è stato validato il significato clinico del miR-126 nei sieri di pazienti affetti da MPM. Il miR-126 è stato analizzato

75

come possibile biomarcatore diagnostico in 44 pazienti con MPM, 196 soggetti esposti all’amianto e 50 soggetti sani. È emerso che questo miRNA può differenziare i soggetti esposti all’amianto dai soggetti sani con una sensibilità del 60% ed una specificità del 74% e dai pazienti con MPM con una sensibilità e specificità del 73%. Nel secondo studio è stato suggerito che il miR-126 circolante nel siero è un marcatore di malattia sensibile, ma che dovrebbe essere comunque utilizzato in combinazione con altri biomarcatori, come SMRP, per aumentare i livelli di specificità (Tomasetti et al., 2012).

Il primo studio, invece, di profiling dei miRNA nel plasma e nel siero è stato condotto da Kirschner et al. (2012) analizzando campioni provenienti da pazienti con MPM e soggetti sani. Considerando 90 miRNA precedentemente riportati come associati al MPM, i livelli di due miRNA, miR-29c e miR-92a sono stati trovati elevati nei campioni di plasma dei pazienti con MPM. Inoltre, 15 nuovi miRNA sono stati trovati in livelli elevati nel plasma dei pazienti con MPM ed in particolare, dopo validazione tramite real-time PCR, gli autori sono stati in grado di dimostrare che i livelli di uno di essi, miR-625-3p, erano significativamente più elevati nel plasma/siero di pazienti con MPM e sembravano avere elevati livelli di specificità, sensibilità e precisione nel differenziare i pazienti con MPM dai soggetti sani e da quelli con asbestosi (AUC=0,8).

Un nuovo approccio, basato sulla conoscenza che i tumori generano una caratteristica “impronta digitale” costituita dai miRNA della frazione cellulare del sangue periferico, ha spinto Weber et al. (2012) ad analizzare potenziali miRNA biomarcatori nella frazione cellulare del sangue periferico di 23 pazienti con MPM, 17 individui esposti all’amianto e 25 soggetti sani. È emerso che i livelli del miR-103 sono in grado di discriminare i pazienti con MPM sia dai controlli sani che dai soggetti esposti all’amianto, con una discriminazione migliore tra MPM e controlli sani (AUC=0,87) rispetto ai soggetti esposti all’amianto (AUC=0,75).

La combinazione di miR-126 con un biomarcatore recentemente scoperto per il MPM, miR-132-3p, misurati nel plasma, ha fornito una potenziale firma diagnostica con una precisione molto più elevata rispetto all’uso di miR-132-3p o miR-126 da soli nel discriminare tra i pazienti con MPM dai soggetti con precedente esposizione all’amianto. La combinazione di questi due miRNA potrebbe distinguere campioni plasmatici di MPM

76

rispetto a quelli di individui esposti all’amianto con una sensibilità ed una specificità rispettivamente del 77 e del 86% (Weber et al., 2017).

Tre nuovi miRNA biomarcatori sierici sono stati identificati recentemente quando Bononi et al. (2016) hanno confrontato i miRNA nel siero di pazienti con MPM, in quello di ex-lavoratori esposti all’amianto e di individui sani. In questo studio, i miRNA identificati includevano miR-197-3p, miR-1281 e miR-32-3p. MiR-197-3p e miR-32-3p erano entrambi espressi a livelli significativamente più alti nei pazienti con MPM rispetto sia agli ex-lavoratori esposti all’amianto sia agli individui sani. MiR-1281 era espresso significativamente più alto in MPM e negli ex-lavoratori esposti all’amianto rispetto agli individui sani. Questi miRNA discriminavano discretamente tra le tre coorti di campioni con una accuratezza diagnostica (AUC) di circa 0,7 per ogni miRNA.

Questi studi dimostrano il potenziale dei miRNA nella diagnosi dei pazienti con MPM e nell’identificazione dei soggetti a rischio. I risultati ottenuti sono incoraggianti in quanto le accuratezze diagnostiche per la maggior parte dei profili di miRNA sono equivalenti o superiori a quelle degli attuali biomarcatori nel siero per la diagnosi del MPM come SMRP, osteropontina e fibulina-3. Tuttavia, sono necessari studi prospettici più ampi per convalidare questi risultati.

La maggior parte dei pazienti con MPM sviluppa un versamento pleurico ed è sorprendente che il potenziale diagnostico del miRNA all’interno dei versamenti pleurici non sia stato ancora studiato a fondo. I versamenti pleurici (PE) vengono regolarmente drenati per alleviare il disagio e sono campioni ideali da analizzare durante il processo diagnostico. Ad oggi c’è un solo studio (Cappallesso et al., 2016) che suggerisce che la misurazione dei miRNA nel versamento pleurico possa aiutare nella diagnosi del MPM. Cappallesso et al. hanno analizzato campioni citologici per valutare il ruolo dei miRNA nella distinzione tra MPM e cellule mesoteliali reattive (RMC), confrontando 29 pazienti con MPM e 24 con cellule mesoteliali reattive (RMC). La combinazione di miR-126 e miR- 21 potrebbe integrare la valutazione citologica del versamento pleurico per differenziare il MPM da RMC con una sensibilità dell’86% e una specificità dell’87%. I risultati di questo studio sono promettenti, ma sono stati analizzati un sottoinsieme di soli 15 miRNA precedentemente associati a MPM e pertanto, miRNA con un’accuratezza diagnostica migliore potrebbero essere stati trascurati (tabella 4).

77

miRNA Matrice Popolazione Misura Statistica

miR-200c, miR-141

Tessuto

100 MPM, AUC > 0,9 per ogni miR-200b, miR-429 32 Adenocarcinoma miRNA

Polmonare

miR-200c, miR-192

Tessuto 48 MPM, Sensibilità 100% miR-193a-3p 136 Carcinomi Specificità 94% miR-126, miR-143

Tessuto

40 MPM, 12 AUC 0,96 per miR-145, miR-652 Biopsie Diagnostiche combinazione miRNA

Abbinate, 14 Pleura Non Neoplastica Abbinata, 5 Mesotelio Reattivo Non Neoplastico

miR-625-3p Siero 5 MPM, 14 sani AUC 0,8 30 MPM, 10 Asbestosi

miR-103 Frazione cellulare di 23 MPM, 17 Esposti AUC 0,75 - 0,87 sangue periferico Amianto, 25 Sani

miR-126

Tessuto 10 MPM, 5 Mesotelio AUC 0,7 Normale

Siero 44 MPM, 196 Esposti Sensibilità 60 - 73% Amianto, 50 Sani Specificità 74% miR-126,

Plasma 22 MPM, 44 Esposti AUC ~ 0,8 per ogni miR-132-3p Amianto miRNA e combinazione miR-197-3p,

Siero 20 MPM, 15 Esposti AUC ~ 0,7 per ogni miR-1281, miR-32-3p Amianto, 14 Sani miRNA

miR-126, miR-21 Campioni Citologici nel Versamento Pleurico

24 Mesotelio AUC 0,92 per Reattivo, 29 MPM combinazione miRNA

Tabella 4. Nella tabella vengono riassunti i principali miRNA implicati nel MPM evidenziando le differenze nelle misure statistiche in relazione al campione analizzato e alle condizioni di salute dei

pazienti.

È stata effettuata, infine, una revisione sistematica ed una meta-analisi qualitativa per i dati esistenti in letteratura riguardo i miRNA (Micolucci et al., 2016). In seguito alla revisione sistematica della letteratura, è stato illustrato un approccio basato sul vote- counting utile per l’identificazione dei miRNA più significativi. Il processo ha fornito un

78

elenco affidabile di candidati aventi le caratteristiche di potenziali biomarcatori e definiti come “mesomiRs” (MM-associated miRNAs) che comprendevano i miRNA tissutali (miR- 16-5p, miR-126-3p, miR-143-3p, miR-145-5p, miR-192-5p, miR-193a-3p, miR-200b-3p, miR-203a-3p e miR-652-3p) ed un pannello costituito da più classi di biomarcatori circolanti (miR-126-3p, miR-103a-3p, miR-625-3p e mesotelina). Questi biomarcatori, avranno bisogno di una validazione standardizzata su larga scala per stabilire se siano in grado di fornire una diagnosi accurata e identificare i pazienti ad alto rischio, come previsto in questo studio.

79

5. BIOMARCATORI IN COMBINAZIONE

Da quando nel 2003 la mesotelina è stata indicata da Robinson et al., come biomarcatore del MPM, sono stati proposti diversi altri biomarcatori diagnostici; tuttavia nessuno di essi ha la caratteristica della combinazione necessaria di sensibilità e specificità per legittimare un suo utilizzo nella pratica clinica. Per questo motivo alcuni studi hanno iniziato ad indagare l’utilità di combinare diversi biomarcatori, scelti fra quelli più interessanti. La mesotelina, il più importante biomarcatore nel sangue, è caratterizzata da elevata specificità, ma bassa sensibilità e poteva essere ragionevole combinarla con altri biomarcatori al fine di migliorarne le prestazioni complessive.

I primi studi effettuati riguardano la combinazione del SMRP con CA-125 (Creaney et al., 2007) e con MPF e OPN (Creaney et al., 2008). In entrambi gli studi la combinazione dei biomarcatori, utilizzando un modello di regressione logistica, non ha migliorato la sensibilità nella diagnosi del MPM rispetto al solo SMRP.

Nello studio condotto da Amati et al. (2008) e già riportato precedentemente nel corso di questa tesi è emerso che la combinazione dei livelli plasmatici del SMRP con 8-OHdG e VEGF ha aumentato notevolmente la sensibilità e la specificità nel discriminare i soggetti ad alto rischio (precedentemente esposti all’amianto) dai controlli sani con una AUC di 0,925; è risultata essere una interessante combinazione per la stratificazione del rischio di MPM in pazienti con una precedente esposizione all’amianto. Inoltre, anche nello studio di Santarelli et al. (2011) è stata valutata la capacità dei biomarcatori di identificare i soggetti ad alto rischio di sviluppare la malattia attraverso la combinazione di SMRP con miR-126. MiR-126 è risultato essere significativamente sottoregolato nel tessuto neoplastico del MPM e la sua espressione può essere valutata facilmente nel siero. Quando combinato con SMRP, miR-126 mostra prestazioni migliori per la discriminazione di soggetti ad alto rischio di sviluppare il MPM, risultando un potenziale indicatore diagnostico per i pazienti nelle prime fasi del MPM.

Una delle prime prove riguardo la buona riuscita di questo approccio è stata fornita da uno studio pubblicato nel 2011 che dimostra un significativo miglioramento delle prestazioni diagnostiche nella diagnosi del MPM epitelioide combinando il SMRP sierico con i dosaggi di OPN nel plasma. Sono stati arruolati 93 soggetti sani, 111 individui con

80

malattia respiratoria benigna (BRD) e 31 pazienti con MPM, confermati istologicamente e/o citologicamente. L’AUC che deriva dalla combinazione di questi due marcatori (0,873) era superiore a quella derivante da ciascuno di essi, ovvero 0,795 per OPN e 0,62 per SMRP (Cristaudo et al., 2011).

Ancora altri studi hanno analizzato varie combinazioni di biomarcatori quali SMRP e miR- 103a-3p (Weber et al., 2014), SMRP, miR-126 e promotore metilato della trombomodulina (Met-TM) (Santarelli et al., 2015) e miR-132-3p insieme a miR-126 (Weber et al., 2017). Nello studio condotto da Weber et al. (2014) sono stati presi in considerazione 43 pazienti maschi con MPM e 52 controlli dello stesso sesso precedentemente esposti all’amianto ed è stata analizzata la concentrazione di SMRP nel plasma ed i livelli di miR-103a-3p nella frazione cellulare di sangue periferico. Per la discriminazione del MPM epitelioide e bifasico dai controlli esposti all’amianto, il SMRP ed il miR-103a-3p hanno mostrato rispettivamente una sensibilità del 74% e dell’89% ed una specificità dell’85% e del 63%. Quando i due biomarcatori venivano usati in combinazione sono state calcolate una sensibilità del 95% ed una specificità dell’81% nel discriminare i due gruppi, mostrando una prestazione migliore rispetto al singolo biomarcatore.

In un altro studio condotto da Santarelli et al. (2015) è stata valutata la combinazione di due biomarcatori epigeneticamente regolati nel MPM (miR-126 e Met-TM) insieme a SMRP. Sono stati presi in esame un totale di 188 soggetti che includevano 45 pazienti con MPM, 99 soggetti esposti all’amianto e 44 controlli sani arruolati in modo prospettico ed è risultato che la combinazione dei tre biomarcatori era il miglior predittore nel differenziare i pazienti con MPM dai soggetti esposti all’amianto e dai controlli sani.

Anche nello studio di Weber et al. (2017), già menzionato nel corso di questa tesi, è stato visto che la combinazione di miR-126 con miR-132-3p, misurati nel plasma, ha permesso di ottenere una sensibilità ed una specificità (rispettivamente del 77 e 86%) superiori rispetto a quella dei miRNA presi singolarmente nel discriminare i pazienti con MPM dai soggetti con precedente esposizione all’amianto.

81

Molto recentemente è stato condotto uno studio (Bonotti et al.,2017), che attraverso un approccio genomico e proteomico preliminare ha permesso di testare nel siero, mediante l’uso di specifici saggi ELISA, una serie di biomarcatori per la diagnosi del MPM. Campioni di siero erano disponibili da 43 soggetti precedentemente esposti all’amianto e da 27 pazienti con MPM, tutti di tipo epitelioide. Tutti i nuovi biomarcatori trovati differenzialmente espressi nei pazienti con MPM rispetto ai soggetti sani, sono stati convalidati nel siero. L’approccio combinato, utilizzando strumenti di genomica e proteomica, si è rivelato altamente innovativo per questo tipo di malattia e ha portato all’identificazione di nuovi biomarcatori sierici nella diagnosi del MPM. Il miglior risultato è stato ottenuto dalla combinazione di sei biomarcatori: SMRP, OPN plasmatica, interleuchina-6 (IL-6), vimentina, desmina ed il fattore di crescita degli epatociti (HGF). Questo pannello ha raggiunto una sensibilità del 100% ed una specificità dell’85,7% al miglior cut-off. Tuttavia, tale risultato necessita di un’interpretazione attenta considerando il piccolo numero di pazienti esaminati. Quindi in definitiva, da tutti questi studi emerge che l’uso di biomarcatori in combinazione potrebbe essere molto utile rispetto all’uso dei singoli biomarcatori nella diagnosi del MPM.

82

6. CONCLUSIONE

Milioni di persone sono state esposte all’amianto in tutto il mondo, causando un continuo aumento di morbilità e mortalità per il MPM ed un alto numero di individui a rischio di sviluppare il MPM. L’aumento dell’incidenza di questa neoplasia non è solo un problema del presente, ma è anche una sfida per gli anni a venire in quanto l’amianto, il principale agente eziologico del MPM, è ancora in fase di elaborazione nei paesi in via di sviluppo e, pertanto, il numero dei casi di MPM è destinato a salire.

Questa neoplasia è quasi sempre diagnosticata in uno stadio avanzato dove i trattamenti chirurgici e farmacologici non hanno dimostrato un significativo prolungamento della sopravvivenza; meno del 5% dei pazienti con MPM sono identificati in una fase iniziale, in quanto lo sviluppo dei sintomi clinici si verifica solitamente quando la malattia è in fase avanzata. Tuttavia, è stato dimostrato che la diagnosi precoce del MPM migliora significativamente la sopravvivenza complessiva. Poiché gli attuali strumenti di screening per il MPM rilevano la malattia in uno stadio avanzato, è stata effettuata in questi anni una ricerca di nuovi biomarcatori che consentano una diagnosi precoce di questa neoplasia. Come analizzato in questa tesi, numerosi biomarcatori sono stati studiati (SMRP, OPN, MPF, Fibulina-3, HMGB-1, miRNAs) e molti sforzi sono già stati fatti in questo ambito, ma la ricerca continua perché non esiste ancora un “gold standard” validato. Il SMRP, che è il biomarcatore sierico più ampiamente valutato per la diagnosi precoce di MPM, sebbene piuttosto specifico, ha mostrato una sensibilità relativamente scarsa. Allo stesso modo, altri biomarcatori (ad esempio OPN e MPF) su cui è stata posta l’attenzione dalla maggior parte dei ricercatori mancano di adeguata sensibilità o specificità. Alcuni biomarcatori scoperti più di recente sono molto promettenti (ad esempio Fibulina-3, HMGB-1, miRNAs), mostrando una migliore prestazione diagnostica rispetto ai più “tradizionali”, ma necessitano di ulteriore conferma. In particolare, HMGB-1, se confermato in una popolazione più ampia e da vari gruppi di ricerca indipendenti, potrebbe essere molto utile, anche come indicatore di esposizione all’amianto. Ad oggi il SMRP sierico è l’unico biomarcatore ematico per il MPM approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) esclusivamente per il monitoraggio della recidiva della neoplasia dopo la terapia e limitatamente alle forme istologiche epitelioide e bifasico.

83

In conclusione, lo stato attuale dei biomarcatori per il MPM non è soddisfacente, ma sicuramente incoraggiante a causa dell’evidenziazione di nuovi possibili biomarcatori più sensibili e specifici. Inoltre, è ipotizzabile che una combinazione dei biomarcatori più performanti e validi, convalidati dagli studi in corso, consentirà una diagnosi precoce e più accurata del MPM nel futuro prossimo.

84

7. BIBLIOGRAFIA

AIRC- Associazione Italiana Ricerca sul Cancro

Alatas F., Alatas O., Metintas M., Golak O., Harmanci E., Demir S. Diagnostic value of CEA, CA 15-3, CA 19-9, CYFRA 21-1, NSE and TSA assay in pleural effutions. Lung Cancer. 2001;31:9–16.

Alley EW, Lopez J, Santoro A, et al. Clinical safety and activity of pembrolizumab in patients with malignant pleural mesothelioma (KEYNOTE-028): preliminary results from a non-randomised, open-label, phase 1b trial. Lancet Oncol. 2017;18(5):623-630. Amati M., Tomasetti M., Scartozzi M., Mariotti L., Alleva R., Pignotti E., Borghi B., Valentino M., Governa M., Neuzil J., Santarelli L. Profiling tumor-associated markers for early detection of malignant mesothelioma: an epidemiologic study. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2008;17:163–170.

Andersen M, Grauslund M, Ravn J, Sorensen JB, Andersen CB, Santoni-Rugiu E. Diagnostic potential of miR-126, miR-143, miR-145, and miR-652 in malignant pleural mesothelioma. J Mol Diagn. 2014;16:418–30.

Atagi S., Ogawara M., Kawahara M., Sakatani M., Furuse K., Ueda E., Yamamoto S. Utility of hyaluronic acid in pleural fluid for differential diagnosis of pleural effusions: likelihood ratios for malignant mesothelioma. Jpn. J. Clin. Oncol. 1997;27:293–297.

Bakker E, Guazzelli A, Ashtiani F, Demonacosb C, Krstic-Demonacos M, Mutti

L. Immunotherapy advances for mesothelioma treatment. Expert Rev

Anticanc (2017) 17(9):799–814.

Benjamin H, Lebanony D, Rosenwald S, Cohen L, Giborri H, Barabash N, Ashkenazi K, Goren E, Meiri E, Morgenstern S, Perelman M, Barshack I, Goren Y, et al. A diagnostic assay based on microRNA expression accurately identifies malignant pleural mesothelioma. Journal of Molecular Diagnostics. 2010;12:771–9.

Birnie K.A., Prêle C.M., Thompson P.J., Badrian B., Mutsaers S.E. Targeting microRNA to

improve diagnostic and therapeutic approaches for malignant

85

Blanquart C, Gueugnon F, Nguyen JM, Roulois D, Cellerin L, Sagan C, Perigaud C, Scherpereel A, Gregoire M. CCL2, galectin-3, and SMRP combination improves the diagnosis of mesothelioma in pleural effusions. J Thorac Oncol. 2012;7:883–9.

Bononi I, Comar M, Puozzo A, Stendardo M, Boschetto P, Orecchia S, Libener R, Guaschino R, Pietrobon S, Ferracin M, Negrini M, Martini F, Bovenzi M, et al. Circulating microRNAs found dysregulated in ex-exposed asbestos workers and pleural mesothelioma patients as potential new biomarkers. Oncotarget. 2016;7:82700–82711. Bonotti A, Foddis R, Landi R, et al. A Novel Panel of Serum Biomarkers for MPM Diagnosis. Dis Markers 2017;2017:3510984.

Boudville N, Paul R, Robinson BW, et al. Mesothelin and kidney function--analysis of relationship and implications for mesothelioma screening. Lung Cancer 2011;73:320-4. Busacca S, Germano S, De Cecco L, Rinaldi M, Comoglio F, Favero F, Murer B, Mutti L, Pierotti M, Gaudino G. MicroRNA signature of malignant meosthlelioma with potential diagnostic and prognostic implications. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2010;42:312–9.

Calabrò L, Morra A, Giannarelli D, Amato G, D’Incecco A, Covre A, Lewis A, Rebelatto MC, Danielli R, Altomonte M, Di Giacomo AM, Maio M. Tremelimumab combined with durvalumab in patients with mesothelioma (NIBIT-MESO-1): an open-label, non randomised, phase 2 study. Lancet Respir Med. 2018; 6(6): 451-460.

Canessa PA, Franceschini MC, Ferro P, et al. Evaluation of soluble mesothelin-related peptide as a diagnostic marker of malignant pleural mesothelioma effusions: its contribution to cytology. Cancer Invest2013;31:43-50.

Cappellesso R, Nicole L, Caroccia B, Guzzardo V, Ventura L, Fassan M, Fassina A. Young investigator challenge: MicroRNA-21/MicroRNA-126 profiling as a novel tool for the