Obiettivi specifici di Arundo 6

Arundo6.6 nasce dall’esigenza di offrire un’alternativa ecosostenibile alla produzione di Nylon6,6 da fonti rinnovabili.

Gli obiettivi dell’idea progetto sono:

— ingegnerizzazione di un microrganismo già identificato per la produ- zione di acido adipico da biomasse lignocellulosiche;

— over–espressione degli enzimi del pathway dell’adipato nel microrga- nismo identificato;

— ottimizzazione del processo di fermentazione per aumentare le rese di acido adipico a partire da biomassa lignocellulosica di Arundo

donax, coltivabile su terreni marginali;

— produzione di esametilendiammina (HMDA), mediante amminazio- ne di acido adipico;

— sintesi del Nylon6,6 100% bio a partire dai bioprecursori ottenuti dagli step precedenti;

— trasformazione del Nylon6,6 per estrusione;

— realizzazione di un prototipo di Stampante3D per l’utilizzo del Nylon 6,6 100% bio.

1.1. Ingegnerizzazione di un microrganismo già identificato per la produzione di

acido adipico da biomasse lignocellulosiche

Diversi microorganismi sono attualmente utilizzati per la produzione biolo- gica di acido adipico e/o dei suoi precursori: Escherichia coli, Saccharomyces

cerevisiae, Pseudomonas putida, Klebsiella pneumonia, Thermobifida fusca, Can- dida tropicalis, ceppi di Arthrobacter o Rhodococcus (Figura2). La maggior

parte dei microrganismi cellulolitici riportati in Figura2 risultano difficili da manipolare geneticamente, mentre gli altri microrganismi, facilmente ingegnerizzabili, non hanno attività cellulolitica.

L’applicazione di manipolazioni genetiche mirate (trasformazione, ri- combinazione omologa e scambio allelico) del microrganismo individuato, a sequenza nota, porterà alla produzione del building block attraverso un’au- mentata resa. Inoltre gli approcci di ingegneria metabolica per la produzione di composti bio–based ad alto valore aggiunto serviranno per aumentare il tasso di degradazione cellulosica e la resa di acido adipico. L’obiettivo del progetto è quello di creare uno schema di bio–processing consolidato (CBP) in cui la cellulosa viene convertita nel building–block desiderato da un unico microrganismo.

1.2. Over–espressione degli enzimi del pathway dell’adipato nel microrganismo

identificato

Il microrganismo selezionato presenta il pathway inverso della degradazione dell’adipato costituito da5 reazioni, ciascuna catalizzata da un enzima diver- so: beta–chetotiolasi,3–idrossiacil–CoA deidrogenasi, 3–idrossiadipil–CoA deidrogenasi,5–carbossi–2–pentenoil–CoA, succinil–CoA sintetasi [4]. Per aumentare la resa finale di acido adipico tutti i geni che codificano per gli enzimi del pathway dell’adipato saranno over–espressi nel microrganismo identificato. Questo studio sarà condotto singolarmente su ogni enzima al fine di comprendere quale di questo sia l’enzima chiave del intero processo su cui lavorare per massimizzare la produzione del building block. Tutti i geni degli enzimi saranno over–espressi attraverso iniziale amplificazione con PCR, clonaggio e trasformazione in cellule di E.coli (BL21 DE3) con successiva purificazione dell’enzima over–espresso. Per validare l’attività dell’enzima over–espresso, si utilizzerà il sistema in vitro cell–free–system per evitare possibili interferenze delle attività biologiche.

1.3. Ottimizzazione del processo di fermentazione

L’ottimizzazione del processo di fermentazione prevede l’utilizzo di bio- masse lignocellulosiche, in particolare della specie Arundo donax, pianta in grado di crescere su terreni marginali non adatti all’agricoltura. Attual- mente, grazie ai precedenti progetti Enerbiochem e Biopolis, sono già state convalidate le metodologie utili per l’ottenimento della fonte di carbo- nio (dalla coltivazione dell’A. donax al suo pretrattamento per ottenere gli zuccheri semplici).

Rispetto ai progetti precedenti, Arundo6.6 presenta il vantaggio che il microorganismo scelto è cellulolitico e questo determina lo snellimento dei processi produttivi a monte della fermentazione. Inoltre, verranno valutati i parametri produttivi durante la fermentazione su scala di laboratorio in modo da massimizzare la produzione di acido adipico, per poi effettuare lo

scale–up su impianto pilota. L’acido adipico così prodotto sarà purificato dal mezzo di coltura attraverso diversi step di filtrazione e distillazione in modo da ottenere un prodotto con un elevato grado di purezza.

1.4. Produzione di esametilendiammina (HMDA)

Parte dell’acido adipico prodotto con il processo di fermentazione, per reazione con ammoniaca, viene convertito in adipato di ammonio (sale di ammonio dell’acido adipico). Quest’ultimo è successivamente disidratato per ottenere il nitrile corrispondente (nitrile adipico). Dal nitrile adipico in seguito ad idrogenazione si ottiene HMDA.

1.5. Sintesi del Nylon 6,6 100% bio

La sintesi del Nylon6,6 100% bio avviene attraverso per policondensazione a stadi dell’acido adipico con esametilendiammina. Per ottenere una fibra di nylon è necessario che il polimero abbia un elevato peso molecolare e questo è possibile solamente utilizzando le stesse quantità stechiometriche dei due reagenti. La reazione prevede la titolazione con esametilendiammina fino alla neutralizzazione di una soluzione acquosa di acido adipico. La soluzione così ottenuta viene trasferita nel reattore di polimerizzazione. Si procede, a questo punto, con la polimerizzazione vera e propria (Figura3), che avviene allo stato fuso, impiegando temperature tra250 e 300°C. Negli ultimi stadi del processo si lavora a pressioni ridotte per sottrarre acqua.

Figura3.Reazione di polimerizzazione del Nylon6,6 (in basso a sinistra) per policonden- sazione dell’acido adipico (in alto a sinistra) con esametilendiammina (in alto a destra) con eliminazione di acqua (in basso a destra).

1.6. Trasformazione per estrusione del Nylon 6,6 100% bio

In seguito alla sintesi, il Nylon6,6 100% bio sarà opportunamente additivato (con antiossidanti, stabilizzanti, coloranti, ecc.) e processato in estrusore al fine di ottenere filamenti di polimero da utilizzare tal quali o granulati

per le successive lavorazioni. Nel novero delle tecnologie più diffuse per la produzione su larga scala di manufatti in Nylon6,6 vi sono lo stampaggio a iniezione e la filatura, mentre per piccole produzioni gli ultimi vent’anni sono stati caratterizzati da una progressiva affermazione della stampa 3D.

La stampa3D di polimeri termoplastici viene effettuata impiegando mate- riale in forma di filamenti avvolti in bobine. Dal momento che tali filamenti dovranno avere un diametro controllato, oltre a un ugello di sezione op- portuna, sarà necessario predisporre, a valle dell’estrusore utilizzato per processare il Nylon6,6 100% bio, un sistema di traino fornito di compa- ratore e feedback al motore del traino per regolare la velocità di tiro e, di conseguenza, il diametro dell’estruso.

1.7. Realizzazione di un prototipo di Stampante 3D

La stampa 3D consente di realizzare oggetti per addizione di materiale, partendo da un modello digitale3D ottenuto con opportuni software.

I principali vantaggi di tale tecnologia sono:

— una produzione compatta, caratterizzata da un rapporto vantaggioso tra il volume occupato della macchina e quello dell’oggetto realizzato; — la possibilità di realizzare pezzi di geometria complessa, già assem-

blati tra loro e con materiali diversi [6].

Recentemente (2009) con la scadenza del brevetto 5.121.329 sulla tecnolo- gia FDM (Fused deposition modelling: modellazione a deposizione fusa), il costo delle stampanti3D è sensibilmente diminuito, rendendole da prima economicamente accessibili alle piccole e medie imprese, nonché agli uffici, e pian piano si sta diffondendo nell’ambito domestico [7]. Ad esempio, è auspicabile che in un futuro non troppo lontano, un pezzo di ricambio in materiale polimerico per un elettrodomestico non venga più venduto fisica- mente, ma che l’azienda possa inviare un file protetto e one shot all’utente finale e che questi possa stamparsi direttamente il ricambio di cui necessita. La riduzione al solo tempo nel download del file e dello stampaggio e la conseguente eliminazione dei tempi e dei costi di spedizione, nonché lo snellimento nella logistica delle aziende fornitrici, sono i principali vantaggi legati alla diffusione a livello globale della stampa 3D.

I materiali attualmente più utilizzati nello stampaggio3D ad uso do- mestico sono l’acido polilattico (PLA) e l’acrilonitrile–butadiene–stirene (ABS). Il PLA è un materiale abbastanza tenace dal punto di vista strutturale, ma diventa molto fragile già alla temperatura di40°C a causa della sua biodegradabilità. L’ABS, invece, è un polimero con una resistenza meccani- ca maggiore del PLA ma ancora insufficiente per applicazioni funzionali,

Tabella1.Valori tipici di alcune proprietà rilevanti dell’ABS e del Nylon6,6 [8–10].

ABS Nylon 6,6

Modulo elastico a trazione [GPa] 2.0 – 2.6 1.6 – 23 Modulo elastico a flessione [GPa] 2.1 – 7.6 1.3 – 19

Resistenza a trazione [MPa] 37 – 110 60 – 240

Resistenza a flessione [MPa] 72 – 97 80 – 260

Allungamento a rottura [%] 3.5 – 50 2.8 – 46

Temperatura di distorsione sotto carico (1.8 MPa) [°C]

88 – 100 65 – 110

Coefficiente di attrito 0.5 0.2 – 0.3

quali lo stampaggio di ingranaggi. Rispetto a tali materiali, il Nylon6,6 è caratterizzato da elevate proprietà meccaniche e da un basso coefficiente di attrito, ed è quindi particolarmente adatto alla produzione funzionale. Un confronto tra le proprietà meccaniche, termiche e tribologiche dell’ABS e del Nylon6,6 è mostrato nella Tabella 1.

Date le elevate temperature di processo (240°C) e la sua elevata igro- scopicità (10% in peso) sarà necessaria una stampante 3D specificamente progettata per questa tipologia di polimero. In particolare, tale stampante sarà provvista di:

— hot end (ugello) in metallo;

— piatto riscaldato a75°C per dare aderenza al materiale ed evitare che esso si deformi;

— elementi innovativi integrati on board per processare il materiale in condizioni ottimali.

Una stampante3D progettata per il Nylon potrà inoltre essere utilizzata per una svariata tipologia di polimeri termoplastici, tra cui l’ABS e il PLA.