I prelievi ematici sono stati eseguiti al tempo T0, T3 e T7 da via venosa o arteriosa presente nei pazienti ricoverati in UTI (per espletare le normali attività di monitoraggio e terapia) o attraverso venipuntura, quando non era presente un accesso vascolare.
I campioni di sangue sono stati raccolti in tre diverse provette sterili: due provette con EDTA (Acido etilendiamminotetraacetico come anticoagulante)(tappo lilla) da 2,5 ml e una provetta con granuli e clot activator da 5ml (tappo bianco grande).
Nei pazienti deceduti nel corso dello studio, i campioni inclusi nelle analisi sono stati quelli ottenuti prima della morte.
Citofluorimetria
La citometria a flusso è una tecnica per la misurazione e la caratterizzazione delle cellule sospese in un veicolo fluido e che si muovono in flusso laminare. Il citometro individua le cellule singole e ne analizza le caratteristiche fisiche singolarmente. Gli strumenti diagnostici in uso sono detti
79 citofluorimetri in quanto integrano la tecnica citometrica con la registrazione e misurazione della fluorescenza emessa da fluorocromi. Infatti le indagini diagnostiche citofluorimetriche sono eseguite marcando le cellule mediante anticorpi monoclonali associati fra loro nel cosiddetto pannello anticorpale. Ogni anticorpo monoclonale è marcato con uno specifico fluorocromo, il quale emette fotoni con particolare spettro di emissione. Il citofluorimetro individua le cellule e misura l’intensità di fluorescenza dei singoli fluorocromi attraverso analisi computerizzata. L’intensità della fluorescenza è in stretto rapporto con la quantità di anticorpo legato alle cellule. Con una singola provetta è possibile definire le caratteristiche antigeniche delle cellule in esame in pannelli che possono comprendere fino a otto anticorpi monoclonali alla volta.
Ogni gruppo di anticorpi monoclonali specifici per un antigene fa parte di un cluster di designazione e differenziazione, detto CD. Un numero specifica il tipo di antigene riconosciuto da tutti i cloni appartenenti allo stesso cluster. Sono stati definiti più di 200 CD.
Funzionamento del citofluorimetro
Il funzionamento del citofluorimetro a flusso può esser riassunto così: una sospensione cellulare monodispersa (ad esempio cellule da sangue periferico) viene convogliata da un sistema fluidifico di trasporto fino al punto di misura, dove incontra un fascio luminoso di alcune decine di µ, focalizzato tramite l’ausilio di una lente e proveniente da una sorgente di eccitazione. Quando il raggio intercetta il flusso cellulare (stream) vengono generati dei segnali dall’incontro di ogni singola cellula. Questi segnali sono legati alle caratteristiche fisiche delle particelle (diametro, rapporto nucleo/citoplasma, granulosità interna, rugosità di membrana), e all’eventuale presenza di molecole fluorescenti localizzate in diversi siti.
Una volta emessi, i segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, e inviati ai rispettivi sensori (fotodiodi e fotomoltiplicatori) che ne misurano l’intensità. Questi segnali elettrici, quindi analogici, vengono amplificati e digitalizzati associati tra loto ed inviati ad un analizzatore/elaboratore di dati che provvede alla loro presentazione su un monitor e alla loro elaborazione statistica.
L’unità fluidifica di un citofluorimetro è costituita da una camera di flusso, nella quale di ottiene la focalizzazione idrodinamica del flusso cellulare (stream): tale focalizzazione consiste nel far in modo che le singole cellule attraversino il punto di intersezione con un fascio di luce, anch’esso focalizzato, mantendosi allineate lungo l’asse di un filo fluido di piccole dimensioni. In pratica, se il regime fluidifico è di tipo laminare si creano due flussi coassiali: quello interno contiene le cellule (core flow) e quello esterno mantiene queste ultime lungo l’asse ideale di flusso (sheat fluid).
80 Le cellule viaggiano lungo l’asse del flusso, ad una velocità che dipende dalla modulazione regolabile del sistema pneumatico, che assicura la circolazione del sistema fluidifico. Esse viaggiano lungo traiettorie quasi identiche, in modo da essere esposte al raggio luminoso per tempi molto brevi e in modo da dar luogo a singoli segnali di fluorescenza o di scatter ben differenziabili.
L’unità ottica di un citofluorimetro è costituita dal sistema generatore del fascio di luce, focalizzato nel punto si intersezione con il flusso cellulare, e dal sistema di raccolta dei segnali di diffusione della luce (provenienti dalle cellule) e dei segnali di fluorescenza (provenienti dai fluorocromi usati per la marcatura cellulare).
La sorgente luminosa impiegata solitamente è un laser. I citofluorimetri associano ormai almeno 2 laser, ad esempio uno ad Argon, con lunghezza d’onda (λ) d’emissione di 488 nm (blu), ed uno ad Elio-Neon con λ d’emissione 633 nm (rosso) . Le diverse combinazioni di laser caratterizzano i diversi citofluorimetri in commercio.
Figura 12. Funzionamento del citofluorimetro
Fluorescenza
I fluorocromi sono molecole, caratteristicamente idrocarburi policromatici o eterociclici, la cui caratteristica principale è l’eccitabilità da parte dei fotoni emessi da sorgenti lumisose come laser.
81 I fotoni eccitanti caratterizzati da una specifica lunghezza d’onda λ sono in grado di render instabile il fluorocromo. Dopo un tempo ridotto (nanosecondi) il fluorocromo torna allo stato iniziale, emettendo fluorescenza, cioè fotoni con minor energia e con λ più lunga.
Ogni fluorocromo è caratterizzato da un determinato range di λ eccitante (spettro di eccitazione) e da un determinato range di λ emessa (spettro di emissione) . Queste caratteristiche condizionano non solo il tipo di sorgente luminosa eccitante impiegabile (il laser del citofluorimetro deve emettere fotoni con λ compresa nello spettro di eccitazione dei fluorocromi utilizzati), ma anche la modalità di associazione di due o più fluorocromi.
Canale di fluorescenza λ λ λ λ (emissione) fluorocromo FL1 550 ±30 FITC = fluorescina isotiocianato
FL2 585 ± 42 PE = ficoeritrina
FL3 >670 PerCP = proteina peridina clorofilla FL4 660 ±30 PECy7 = coniugato di PE e cianina dye FL5 >670 APCCy7 = combinazione di APC e cianina dye
FL6 >670 APC = alloficocianina
FL7 500 Horizon-V500
FL8 448 혴orizon-V450
Tabella 12. Esempio dei fluorocromi impiegabili nell’analisi a sei colori con un citofluorimetro FACSCanto
La luce del raggio laser viene dispersa secondo due direzioni:
- In avanti (forward scatter, FSC) entro una modestissima angolatura per il fenomeno di diffrazione ed è correlato con le dimensioni cellulari (cresce al crescere delle dimensioni cellulari);
- ortogonalmente a 90° (side scatter, SSC), per i fenomeni di riflessione e rifrazione, e dipende dalla complessità intracellulare (es. granulosità, morfologia del nucleo, ecc). Il FCS viene raccolto da un fotodiodo ed è scarsamente influenzato dalla fluorescenza, mentre il SCC e la fluorescenza sono raccolti in maniera diversificata. In particolare, i segnali di fluorescenza sono sottoposti ad un’analisi spettrale mediante specchi dicroici e filtri ottici, e sono raccolti da fotomoltiplicatori necessari per un’amplificazione dei segnali stessi.
82 L’unità elettronica di un citofluorimetro è costituita dal sistema di rilevazione, amplificazione, analisi, rappresentazione e stampa dei dati. Una volta che tutti i dati relativi ad un processo di acquisizione sono registrati in un data file, tutte le operazioni successive sono gestite da un software. Qualunque sia il software utilizzato, i dati sono mostrati tramite istogrammi mono- o bi- parametrici.
In genere in citometria di eseguono correlazioni tra più parametri. Per questo motivo si impiegano più comunemente diagrammi bi-parametrici quali dot-plot o countour plot o denisty-plot.
Principali applicazioni
L’applicazione più comune riguarda la ricerca di markers cellulari di membrana (fluorescenza di superficie), ma è possibile ricercare anche markers intracellulari (citoplasmatici o nucleari) impiegando metodi di permeabilizzazione delle cellule, che permettano l’ingresso degli anticorpi marcati con i fluorocromi e allo steso tempo garantiscano la conservazione dell’integrità e delle caratteristiche di scatter delle cellule.
Il test citofluorimetrico routinario più frequentemente richiesto è la tipizzzazione linfocitaria. Consiste nella determinazione del fenotipo dei linfociti circolanti e fornisce informazioni utili nella diagnosi di: stati reattivi (virosi), presenza di linfociti clonali (linfomi non-Hodgkin leucemizzanti), infezioni da HIV (conteggio assoluto dei linfociti CD4+), anomalie fenotipiche in corso di stati congeniti o acquisiti di immunodeficienza. I sottotipi dei linfociti sono individuati mediante l’impiego di anticorpi monoclonali diretti contro specifici markers T, B ed NK.
Una volta conosciuta la percentuale dei singoli sottotipi linfocitari, è possibile calcolarne il numero assoluto in base la numero dei linfociti indicato dall’esame emocromo (analisi in “doppia
piattaforma”).
Siccome tutte le cellule del sistema emopoietico, ad eccezione di eritroblasti ed eritrociti, sono positivi per l’antigene leucocitario comune CD45, l’analisi citofluorimetrica deve esser effettuata previa esecuzione di un gate elettronico che comprenda solo gli eventi CD45+.
Nei citogrammi che analizzano l’espressione del CD45 ed il SCC è possibile osservare una diversa distribuzione delle popolazioni leucocitarie. Infatti, ognuna delle popolazioni circolanti è caratterizzata da una diversa complessità di membrana, del citoplasma e del nucleo. La combinazione di queste caratteristiche permette di ottenere citogrammi nei quali la localizzazione delle popolazioni leucocitarie è distribuita differente. 59
83 Per lo studio delle molecole di superficie cellulare con citofluorimetria il campione ematico è stato raccolto in una provetta EDTA e analizzata dalla Sezione di Citofluorimetria presso la Divisione di Ematologia dell’AOUP.
È stata eseguita un’analisi immunofenotipica a sei fluorescenze con precedura di gating CD45/SCC con citofluorimetro FACSCanto II a 3 laser: Argon, con lunghezza d’onda (λ) d’emissione di 488 nm (blu), He-Ne con λ d’emissione 633 nm (rosso) e Violet diode λ d’emissione 405 nm (violetto). Sono stati utilizzati 2 pannelli anticorpali, ciascuno dei quali formato da 6 anticorpi monoclonali specifici per un CD legati ad altrettanti fluorocromi, in modo da analizzare contemporaneamente l’espressione sulla superficie cellulare di diversi CD.
fluorocromi FITC PE PERcp PECy7 APC APCCy7 V450 TUBO 1 CD4 CD127 CD3 CD25 CD56 CD45 CD8
TUBO 2 CD64 CD23 HLA-DR CD19 CD45 CD14
Tabella 13. Pannelli anticorpali utilizzati nello studio
Il primo tubo consente la valutazione della conta percentuale dei linfociti T CD4+, CD8+ e NK, e dell’espressione del CD127 e del CD25 sui Ly CD4+ e dell’espressione del CD127 sia sui Ly CD4+ che CD8+; mentre il secondo tubo consente di valutare l’espressione del HLA-DR sui monociti, la conta percentuale dei Ly B e l’espressione del CD23 su questi e di valutare l’espressione del CD64 sui neutrofili.
Tecnica per lo studio dei linfociti T (sottopopolazioni e fenotipo) e NK
I linfociti T sono definiti dall’espressione sulla superficie cellulare di CD3, quindi vengono identificati con CD3 legato a PERC-cp. I linfociti T CD3+ così valutati sono stati distinti nelle sottopopolazioni T helper CD4+ (CD4- FITC), T citotossici CD8+ (CD8-V450), T regolatori CD4+CD25+CD127low (CD4-FITC, CD25PECy7, CD127-PE). Per ogni sottopopolazione i valori sono espressi come percentuale entro la popolazione dei linfociti T. E’ stata inoltre valutata ed espressa in percentuale l’espressione del IL7R (CD127) sia su TCD4+ sia su TCD8+.
I linfociti NK sono definiti dall’immunofenotipo CD3−CD56+ (CD56-APC) e la loro presenza è stata espressa come percentuale nella popolazione totale dei linfociti.
84 Tecnica per lo studio dei linfociti B
I linfociti B sono stati rilevati con CD19-PECy7 ed espressi come percentuale entro la popolazione totale dei linfociti. Sui linfociti B così identificati è stata valutata l’espressione del CD23 (CD23-PE) ed espressa come percentuale entro la popolazione dei linfociti B.
Tecnica per lo studio dei livelli di mHLA-DR
La procedura consiste in una doppia marcatura delle cellule con due anticorpi: un anticorpo specifico per i monociti (CD14- V450) e HLA-DR- PerCP . L’espressione di mHLA-DR è valutata attraverso la fluorescenza del PerCP sui monociti identificati sulla base dell’espressione di CD14. I risultati sono stati espressi come percentuale di monociti positivi per HLA-DR entro la popolazione totale dei monociti.
Tecnica per lo studio dei livelli di CD64 sui neutrofili
È stato utilizzato CD64-FITC e i risultati sono stati espressi come percentuale entro la popolazione dei granulociti neutrofili.
La conta assoluta per ogni sottotipo linfocitario è stata ottenuta con “analisi in doppia piattaforma”, cioè utilizzando il citofluorimetro per ottenere i valori percentuali dei singoli sottotipi e il contaglobuli (utilizzato routinariamente per l’esame emocromo) per la conta assoluta dei leucociti (WBC) e la percentuale dei linfociti totali (esempio per il conteggio dei linfociti T CD4+ si esegue secondo la formula: % CD4 x % Linfociti x WBC = Conteggio assoluto dei CD4+ cells/μl).
Dosaggio dei livelli di IL10, TNFαααα, INFγγγγ circolanti
Per l’analisi delle citochine plasmatiche (IL10, TNFα, INFγ) il campione ematico è stato raccolto in una provetta EDTA ed inviato al Laboratorio di Patologia Clinica dell’AOUP. In laboratorio i campioni sono stati centrifugati per separare il plasma e successivamente stoccati in fino all’analisi. I livelli sono stati misurati con tecnica ELISA. Come valori di riferimento sono stati utilizzati quelli proposti dal laboratorio:
Citochina Valori di riferimento IL10 < 8,9 pg/ml TNFα < 14pg/ml
85
Misura dei livelli delle classi di Immunoglobuline sieriche IgG, IgM, IgA
Per l’analisi dei livelli plasmatici delle immunoglobuline il campione ematico è stato raccolto in una provetta con granuli e clot activator da 5ml ed inviato all’U.O. Laboratorio di Analisi Chimico- cliniche dell’AOUP. Le immunoglobuline sono state misurate con tecnica nefelometrica. Le alterazioni dei livelli delle immunoglobuline sono stati definiti secondo il range utilizzato dal laboratorio:
classe di Ig Valori di riferimento IgG 700-1600 md/dl
IgA 17-400 md/dl
RISULTATI
Caratteristiche demografiche e cliniche
In questo studio sono stati inclusi 12 pazienti che si presentavano con shock all’ammissione in UTI, i cui dati di dettaglio sono riportati nelle tabelle allegate.
Nel campione preso in studio l’età media è di 64 anni (± 14) e la composizione è prevalentemente maschile (M/F = 10/2).
La gravità clinica all’ammissione stimata con scores SAPS II e SOFA rispettivamente.
La media della permanenza in UTI è di 10 giorni, con 2 pazienti a lunga degenza (>30 giorni di degenza in UTI). Nel periodo del monitoraggio (8 giorni) sono deceduti 4 pazienti in seguito alla refrattarietà dello shock settico (2 tra T0 e T3, 2 tra T3 e T7).
La valutazione dell’outcome a 28 giorni avevano superato la fase acuta della malattia e
L’infezione primitiva è localizzata nella ma
perforazioni intestinali (3), da deiescenza di anastomosi chirurgiche (1), da annessite (1)). Le altre localizzazioni, in ordine di frequenza, sono quella urinaria (2), polmonare (2), mediastino (1) e pleura(1). Per 1 paziente la sede primitiva dell’infezione non è stata localizzata, ma si riscontravano emocolture positive.
L’agente microbico è stato documentato con esami colturali in 9 casi, con una prevalenza di infezioni di infezioni da gram
Caratteristiche demografiche e cliniche
In questo studio sono stati inclusi 12 pazienti che si presentavano con shock i cui dati di dettaglio sono riportati nelle tabelle allegate.
Nel campione preso in studio l’età media è di 64 anni (± 14) e la composizione è prevalentemente
La gravità clinica all’ammissione stimata con scores SAPS II e SOFA è in
La media della permanenza in UTI è di 10 giorni, con 2 pazienti a lunga degenza (>30 giorni di degenza in UTI). Nel periodo del monitoraggio (8 giorni) sono deceduti 4 pazienti in seguito alla
k settico (2 tra T0 e T3, 2 tra T3 e T7).
La valutazione dell’outcome a 28 giorni mostra un tasso di mortalità del 12,5% tra i pazienti che avevano superato la fase acuta della malattia e del 42 % globale.
L’infezione primitiva è localizzata nella maggior parte dei casi all’addome (peritoniti da perforazioni intestinali (3), da deiescenza di anastomosi chirurgiche (1), da annessite (1)). Le altre localizzazioni, in ordine di frequenza, sono quella urinaria (2), polmonare (2), mediastino (1) e ). Per 1 paziente la sede primitiva dell’infezione non è stata localizzata, ma si riscontravano emocolture positive.
L’agente microbico è stato documentato con esami colturali in 9 casi, con una prevalenza di infezioni di infezioni da gram – (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterobatteri, 86 In questo studio sono stati inclusi 12 pazienti che si presentavano con shock settico
i cui dati di dettaglio sono riportati nelle tabelle allegate.
Nel campione preso in studio l’età media è di 64 anni (± 14) e la composizione è prevalentemente
media di 60 e 12 ,
La media della permanenza in UTI è di 10 giorni, con 2 pazienti a lunga degenza (>30 giorni di degenza in UTI). Nel periodo del monitoraggio (8 giorni) sono deceduti 4 pazienti in seguito alla
un tasso di mortalità del 12,5% tra i pazienti che
ggior parte dei casi all’addome (peritoniti da perforazioni intestinali (3), da deiescenza di anastomosi chirurgiche (1), da annessite (1)). Le altre localizzazioni, in ordine di frequenza, sono quella urinaria (2), polmonare (2), mediastino (1) e ). Per 1 paziente la sede primitiva dell’infezione non è stata localizzata, ma si
L’agente microbico è stato documentato con esami colturali in 9 casi, con una prevalenza di eumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterobatteri,
87 Proteus vulgaris) rispetto a gram + (S.aureus, S.epidermidis). Da notare come 6 casi fossero da attribuire ad infezioni polimicrobiche e frequentemente siano implicati anche miceti (Candida glabrata).
Nel paziente in cui non è stato possibile accertare l’agente microbico responsabile, l’infezione può esser ben sospettata dal prelievo , in sede chirurgica, di materiale purulento in cavità addominale. Tra i survivors 2 pazienti hanno sviluppato infezioni nosocomiali (entrambi pazienti a lunga degenza in UTI): si riscontra infezione da Acinetobacter baumanii e Candida glabrata sulla ferita chirurgica di un paziente ed infezione da Candida albicans a livello di cute e faringe (sedi controllate con i tamponi per lo screening delle infezioni nosocomiali in UTI) nell’altro paziente. Va evidenziato come questi patogeni non siano molto virulenti e l’infezione da parte di questi agenti si associa solitamente ad uno stato di immunocompromisisone dell’organismo ospite. Infine, un paziente, nel corso della degenza ospedaliera, ha manifestato la riattivazione del’HSV a livello labiale e dell’emivolto (dato clinico che conferma la depressione del sistema immunitario).
88
Studio della componente cellulare
Conta leucocitaria
Al momento dell’ammissione (T0) i pazienti presentavano per il 25% leucocitosi, il 42% leucopenia e il 33% valori di globuli bianchi nel range di normalità.
Analizzando le variazioni della conta dei globuli bianchi nel periodo del monitoraggio si osserva che:
- i pazienti con leucocitosi all’ammissione mantenevano nel tempo questa condizione (leucocitosi persistente);
- i pazienti con valori di globuli bianchi normali al T0 sviluppavano una risposta con leucocitosi (con un picco al T3);
- i pazienti con leucopenia al T0 mostravano, in media, un incremento nella conta leucocitaria fino a valori nel range di normalità con un picco al T3 e un calo al T7, rimanendo nel range di normalità.
grafico 1. Anadamento conta leucocitaria
Dall’analisi del campione si può notare che i 2 pazienti deceduti prima del secondo monitoraggio (prima del T3) presentavano entrambi leucopenia al T0 (0,65 e 3,38 10³/µl).
0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 tempo
WBC
leucocitosi ammissione leucopenia ammissione vn T0 T3 T789
grafico 2. Punteggio SAPSII in base alla conta leucocitaria
grafico 3. Andamento SOFA in base alla conta leucocitaria
50,00 52,00 54,00 56,00 58,00 60,00 62,00 64,00 66,00 T0
SAPS II
leucocitosi leucopenia vn 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 T0 T3 T7SOFA
leucocitosi leucopenia vn90 Formula leucocitaria
Sono ben evidenti le alterazioni della formula leucocitaria in tutti i pazienti del campione e in tutte e misurazioni del monitoraggio. (Nell’analisi dei dati sono stati presi in considerazione i valori percentuali e assoluti solo dei neutrofili, linfociti e monociti)
In generale si osserva una predominanza dei granulociti neutrofili rispetto agli altri tipi leucocitari. La conta percentuale dei neutrofili risulta maggiore rispetto ai valori di riferimento in tutti i pazienti al T0 e al T3, mentre al T7 risulta nella normalità per 2 pazienti. Nel corso del monitoraggio si assiste ad un trend discendente nella percentuale dei neutrofili, parallelamente ad un incremento, seppur lieve nelle percentuali dei linfociti e dei monociti.
La conta percentuale dei linfociti risulta ridotta in tutti i pazienti al T0 e al T3 e nel 87,5 % dei pazienti al T7. In particolare considerando i valori mediani della percentuale dei linfociti 7%, 8% e 10,1% rispettivamente al T0, T3e T7 si nota una progressione, pur rimanendo al di sotto dei valori percentuali di riferimento (20-50%).
La conta percentuale dei monociti presenta delle differenze nel campione in studio: al T0 41,5% mostravano una riduzione della percentuale della popolazione monocitica, che nel corso del monitoraggio si portava a valori compresi nel range di riferimento con un trend crescente.
Tipi di leucociti Valori di riferimento T0 T3 T7
neutrofili 40-75% 88,1% 86,1% 83,3%
linfociti 20-50% 7,4% 8,8% 10,3%
monociti 2-13% 3,6% 3,7% 7,4%
Tabella 14. Formula leucocitaria: i valori di riferimento della formula sono quelli forniti dal laboratorio
dell’AOUP; i valori dei pazienti sono riportati come media della popolazione totale in studio
grafico 4. Andamento della formula leucocitaria a T0, T3, T7
0 20 40 60 80 100 tempo
formula leucocitaria
% neutrofili % linfociti % monociti91 Nei grafici precedenti sono riportati i valori percentuali medi della formula leucocitaria di tutti i pazienti nei tre diversi tempi esaminati.
90% 7%
3%