Valutazione dell’attività antimicrobica degli estratti in vitro mediante Agar Well Diffusion Assay

L’attività antimicrobica degli estratti fenolici ottenuti dal germe di frumento, nonché quella dei singoli standard degli acidi fenolici (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), riscontrati all’interno dell’estratto in seguito ad identificazione HPLC, è stata esaminata mediante la tecnica Agar Well Diffusion Assay.

I risultati dell’Agar Well Diffusion Assay riportati in tabella 6.19 hanno permesso di ottenere uno screening rapido volto all’accertamento dell’attività antimicrobica degli estratti fenolici e dei singoli acidi fenolici. Infatti, la misura dell’alone d’inibizione fornisce una preliminare e rapida stima quali-quantitativa dell’attività antimicrobica di una determinata molecola o sostanza essendo direttamente proporzionale all’intensità dell’effetto inibitorio (Pongtharangkul & Demirci, 2004).

Le specie microbiche utilizzate per le prove di Agar Well Diffusion sono state scelte in quanto rappresentano le principali specie alteranti che si riscontrano durante la conservazione degli alimenti e sono la causa del deterioramento del prodotto con conseguente perdita di shelf life. Dai dati è emersa una differente efficacia antimicrobica espressa dalle componenti libere e legate presenti nel germe. In dettaglio, l’estratto costituito dai fenoli liberi del germe non ha fatto registrare alcuna azione inibitoria nei confronti dei ceppi indicatori; mentre l’estratto di fenoli presenti in forma legata nel germe, pur se con differente intensità, ha prodotto l’inibizione della totalità dei ceppi microbici oggetto dello studio (Tabella 6.20, Figura 6.11).

109 Tabella 6.20. Risultati dell’Agar Well Diffusion Assay Test dell’estratto di germe e dei singoli acidi fenolici nei confronti dei ceppi microbici oggetto di studio. I dati sono espressi in mm di diametro dell’alone d’inibizione e rappresentano la media di tre determinazioni con relativa deviazione standard

Ceppo microbico Diametro alone (mm) Estratto germe Fenoli legati Acido Vanillico (conc. 2g/100g) Acido Siringico (conc. 2g/100g Acido Trans- ferulico (conc. 2g/100g) Acido p- cumarico (conc. 2g/100g) Siringaldeide (conc. 2g/100g) P. putida 17,3±0,5 10,9±0,4 10,1±0,4 10,4±0,2 14,0±0 10,5±0 P. fluorescens 17,2±0,3 10,5±0,5 10,4±0,2 9,6±0,6 14,8±1,5 17,3±0,3 P. fragi 18,5±0 11,1±0,2 10,7±0,3 10,8±0,3 15,8±0,7 13,0±1,4 L. innocua 11,7±1,2 10,9±0,2 10,2±0,3 9,0±0 10,6±0,2 14,2±0,4 C. sporogenes 12,2±0,3 10,8±0,3 10,3±0,5 10,3±0,6 11,5±0,4 11,8±0,3 B. thermosphacta 11,0±0 12,0±0 11,8±0,3 11,1±0,2 11,1±0,4 11,0±0

a)

b)

c)

d)

e)

f)

Figura 6.11. Attività inibitoria dell’estratto di germe (liberi e legati) per i 3 ceppi di Pseudomonas spp oggetto di studio (a,b,c) e per i ceppi di L. innocua, C. sporogenes, B. thermosphacta (d, e, f)

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Il differente comportamento dell’estratto di fenoli liberi rispetto a quello dei fenoli legati è da ricondurre sicuramente al contenuto totale di fenoli stessi nei due estratti. Infatti, come emerso dall’analisi cromatografica, l’estratto di fenoli legati risultava essere caratterizzato da un contenuto di acidi fenolici totali pari a 1213,26 mg/Kg, mentre l’estratto di fenoli liberi esibiva un livello di acidi fenolici totali pari ad appena 13,7 mg/Kg.

L’azione inibitoria più marcata, espressa dall’estratto di polifenoli legati nel germe, è stata prodotta nei confronti dei tre ceppi Gram negativi riconducibili alle specie P. putida, P. fragi e P. fluorescens. Di minore intensità è stata l’inibizione registrata nei confronti dei tre ceppi Gram positivi oggetto dello studio e riconducibili alle specie C. sporogenes, L. innocua e B. thermosphacta. L’evento inibitorio, di più elevata intensità nei confronti dei Gram negativi, rispetto ai Gram positivi, appare meritevole di riflessioni. Infatti, come ampiamente riportato in letteratura (Al-Reza et al., 2010; Burt, 2004; Kim et al., 2013), le forme batteriche Gram negative, rispetto a quelle Gram positive sono generalmente meno sensibili agli estratti vegetali. Dunque, l’estratto fenolico ottenuto dal germe potrebbe essere in possesso di peculiarità antimicrobiche di particolare interesse.

Al fine di meglio delineare la correlazione tra l’evento inibitorio e l’eventuale molecola, o gruppo di molecole, alla base dell’inibizione, è stata indagata l’intensità dell’azione antimicrobica espressa da ciascun acido fenolico presente nell’estratto fenolico del germe. Tra i singoli composti fenolici presenti nell’estratto legato, utilizzati tutti ad una concentrazione di 2g/100g, la siringaldeide e l’acido p-cumarico sono quelli che hanno prodotto la più elevata attività inibitoria nei confronti dei ceppi oggetto di studio, mentre per gli altri acidi fenolici (acido vanillico, acido siringico e acido trans-ferulico) è stata registrata un’azione inibente di minore intensità.

Come è possibile apprezzare dalla Tabella 6.20 l’azione inibitoria espressa dalla maggior parte degli acidi fenolici appare sostanzialmente simile nei confronti dei batteri sia Gram negativi sia Gram positivi. Tuttavia occorre segnalare un comportamento di distinguo esibito dall’acido p-cumarico e dalla siringaldeide; in dettaglio, il primo ha fatto apprezzare un’azione antimicrobica più marcata nei confronti di tutte le specie riconducibili al genere Pseudomonas e il secondo ha prodotto una più intensa inibizione nei confronti di P. fluorescens.

Sicuramente sulla base dei risultati ottenuti, appare piuttosto arduo formulare un’ipotesi a supporto della più marcata e inattesa azione inibitoria espressa dall’estratto fenolico nei confronti dei ceppi Gram negativi. Tuttavia, è possibile ritenere che l’acido p-cumarico e la

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siringaldeide, nonché la particolare combinazione della totalità degli acidi fenolici, potrebbero essere alla base della maggiore sensibilità mostrata da parte dei ceppi Gram negativi riferibili a Pseudomonas spp.

6.5

Determinazione della Minima Concentrazione Inibente (MIC)

I risultati relativi alla determinazione della MIC hanno permesso di definire con esattezza la concentrazione minima di composti fenolici presenti in forma legata nel germe, necessaria per l’inibizione di ogni singolo ceppo microbico.

I risultati relativi alla MIC, espressa come g/L di acido fenolico, per ciascun microrganismo indicatore, sono riportati in tabella 6.21.

I dati ottenuti sono risultati essere solo in parte concordi con quanto già osservato mediante la preliminare tecnica di valutazione dell’attività inibitoria condotta mediante Agar Well Diffusion Assay.

Tabella 6.21. Valori di MIC rilevati per i ceppi oggetto di studio

Ceppo microbico Acido Vanillico (g/L) Acido Siringico (g/L) Acido Trans- ferulico (g/L) Acido p- cumarico (g/L) Siringaldeide (g/L) P. putida 6 6 7 12 6 P.fluorescens 14 9 15 13 6 P. fragi 13 12 13 15 4 L. innocua 14 8 17 17 15 C. sporogenes 14 13 17 12 13 B. thermosphacta 8 9 9 8 2

In dettaglio, i dati ottenuti confermano la maggiore resistenza esibita dai Gram positivi riconducibili alle specie L. innocua e C. sporogenes. Trova inoltre conferma, nei dati della MIC, la più elevata sensibilità delle specie di Pseudomonas, rispetto agli altri ceppi, nei confronti della siringaldeide. Al contrario, non appare pienamente confermata la sensibilità, precedentemente riscontrata mediante AWDA, da parte di queste ultime specie nei confronti dell’acido p-cumarico. Infatti, il più basso valore di MIC espresso dall’acido p-cumarico (8 g/L) è stato registrato nei confronti del ceppo riconducibile a B. thermosphacta, mentre verso le specie di Pseudomonas la MIC dell’acido p-cumarico permane intorno a valori uguali o superiori a 12 g/L.

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Occorre evidenziare, inoltre, che livelli di MIC di più bassa entità sono stati prodotti nei confronti di P. putida, e B. thermosphacta da parte dell’acido vanillico, siringico e trans- ferulico.

I dati ottenuti, pur se offrono importanti informazioni, ancora una volta, non consentono di giungere ad una chiara correlazione tra l’evento inibitorio prodotto dall’estratto fenolico e le specifiche sostanze di cui è composto. La mera somma dell’azione inibitoria espressa da ciascun acido fenolico non giustifica pienamente l’evento antagonista espresso dall’estratto fenolico nei confronti dei differenti microrganismi saggiati.

Dunque, è possibile ritenere che l’inibizione microbica prodotta dall’estratto è un processo piuttosto complesso, probabilmente basato sulla presenza di differenti “ostacoli” e, pertanto, dovuto non solo all’azione di un singolo composto fenolico, ma alla partecipazione sinergica di più sostanze fenoliche presenti nell’estratto, che potrebbero incrementare l’effetto delle sostanze prese singolarmente. Inoltre, la struttura chimica che possiedono e la tipologia di composti a cui possono essere legati, sono ulteriori fattori da tener presente e che possono essere alla base delle proprietà protettive dell’estratto di germe nei confronti dei microrganismi indesiderati.

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Sezione II

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Capitolo 1. Quinoa (Chenopodium quinoa Willd)