Microscopia vibrazionale coerente

S

APIENZA

U

NIVERSITÀ DI

R

OMA

F

S

M

, F

N

CORSO DILAUREA INFISICA

M

ICROSCOPIA VIBRAZIONALE COERENTE

Tesi di Laurea Triennale in Fisica

Relatore

Laureando

Prof. Tullio Scopigno

Valeria Venturini

(matricola 1466919)

Introduzione

La microscopia è una tecnologia chiave che permette di caratterizzare gli oggetti nelle scienze della vita. Il nostro concetto di mondo fisico è strettamente legato a quello che vediamo intorno a noi, infatti, per la gran parte della storia, le osservazioni venivano fatte esclusivamente per mezzo dell’occhio umano, sensibile ad una piccola parte dello spettro elettromagnetico e alle dimensioni tipiche degli oggetti che ci circondano, molto diverse dal mondo microscopico e macroscopico. Si scoprì che, guardando l’universo con una luce diversa ovvero con lunghezze d’onda invisibili per l’occhio umano, si riescono a vedere nuovi tipi di oggetti; si osservano ad esempio galassie, stelle e buchi neri con i telescopi a raggi x e una cosa analoga accade per il mondo microscopico. Dalla scoperta delle proprietà delle lenti, già descritta da Seneca più di Duemila anni fa, fino alla scoperta dei microscopi avvenuta tra la fine del Sedicesimo e il Diciassettesimo secolo in Germania, ci si interessò sempre più al mondo microscopico. Nel Diciannovesimo secolo ci fu un notevole sviluppo dei microscopi, grazie alla loro commercializzazione (attribuita a Carl Zeiss), che furono usati intensivamente per fare imaging biologico e cellulare. Questo non forniva però informazioni chimiche, indispensabili per capire le proprietà microscopiche dei materiali [5]. Parallelamente, nel 1928 fu teorizzato e scoperto l’effetto Raman, per merito di Raman e del suo assistente Krishnan, per cui vinsero il Nobel per la Fisica nel 1930. É l’effetto di diffusione anelastica della radiazione elettromagnetica da parte della materia a causa dell’interazione con i moti rotovibrazionali di essa, che si traduce nell’emissione di luce a frequenza diversa di quella incidente; la sua versione stimolata, in cui si utilizza un ulteriore impulso luminoso, è alla base dei processi di Coherent Raman Scattering (CRS). Quando i due laser sono in risonanza con una caratteristica frequenza vibrazionale del campione, tutte le molecole oscillano in fase: la coerenza vibrazionale rende la risposta del Raman di molti ordini di grandezza più grande di quella Raman spontanea. Alla base di questi processi vi è l’interazione non lineare tra luce e materia del terzo ordine nella suscettività elettrica: bisogna considerare gli effetti non lineari quando le intensità in gioco sono così alte che il potenziale di richiamo degli elettroni non è più nell’approssimazione armonica e quindi la polarizzazione P (t) è espressa in serie di E(t).

La microscopia vibrazionale coerente, ottenuta combinando un microscopio con uno spettrometro Raman, sotto le condizioni del CRS, fornisce tecniche di imaging non invasivo e label-free che si basano solo sulle vibrazioni molecolari, contrasto chimico naturale. L’analisi vibrazionale unita alla microscopia permette infatti di son-dare le vibrazioni dei materiali a scala submicrometrica o anche di singola molecola. Essa trova notevoli applicazioni in numerosi campi come la biochimica (nello studio della struttura delle cellule e dei cambiamenti che avvengono a causa di fattori [19]), biomedicina (studiando le differenze tra tessuti sani e malati), scienza dei materiali,

farmacologia e beni culturali (per lo studio dei pigmenti pittorici [18]) anche se il futuro del Raman è, secondo molti, nel settore biologico e medico. In particolare, recenti ricerche mostrano l’utilizzo dell’ SRS per studiare i tumori celebrali [20] e l’utilizzo del CARS per lo studio delle cellule cancerose in tessuti mammari umani [9]. Negli ultimi 50 anni il progresso delle scienze dalla vita è stato spinto in avanti dalla comprensione dei meccanismi biologici a livello molecolare. Ogni componente biologico è caratterizzato da uno spettro vibrazionale che riflette la propria struttura interna in termini di proprietà chimiche. Le applicazioni in questi campi sono favori-te dal fatto che l’acqua è praticamenfavori-te Raman-trasparenfavori-te, motivo per cui l’elevata presenza di acqua in questi materiali non è un problema.

Questa dissertazione si propone di dare una introduzione alla microscopia vibra-zionale coerente dandone un background teorico (effetto Raman; CARS, SRS, RIKES) seguito poi da una parte sperimentale: l’esperimento, condotto all’ IIT, consiste in uno spettro CARS ed uno spettro RIKE con la tecnica della Balanced Detection (BD) su acetone. É suddivisa in tre capitoli più le conclusioni:

Capitolo 1 è dedicato all’effetto Raman, spontaneo e stimolato, descritto secondo trattazioni classiche.

Nel Capitolo 2 si cerca di dare un background teorico all’interazione non lineare tra campo elettromagnetico e materia e poi alle tecniche spettroscopiche di CRS: CARS (e alla soppressione del contributo non risonante), SRS e RIKES e alla sua versione BD-.

Il Capitolo 3 è dedicato alla parte sperimentale: si descrive l’apparato sperimentale, si riportano e commentano i risultati ottenuti.

Indice

Introduzione ii

1 Effetto Raman 1

1.1 Raman spontaneo . . . 1

1.2 Raman stimolato . . . 3

2 Spettroscopia Raman Coerente 5 2.1 Interazione non lineare luce-materia . . . 6

2.2 CARS . . . 7

2.2.1 Soppressione del contributo non risonante . . . 10

2.3 SRS . . . 12

2.4 RIKE(S) . . . 13

2.4.1 BD-RIKE . . . 15

3 Apparato sperimentale e risultati ottenuti 17 3.1 Apparato sperimentale . . . 17 3.1.1 Operazioni preliminari . . . 19 3.1.2 OPO . . . 20 3.2 Risultati ottenuti . . . 20 3.2.1 CARS . . . 20 3.2.2 BD-RIKE . . . 21 3.2.3 Confronto e conclusioni . . . 22 4 Conclusioni 28 iii

Capitolo 1

Effetto Raman

Nel 1928 C.V. Raman e K.S. Krishnan pubblicarono un articolo su Nature, A New Type of Secondary Radiation [1], per cui vinsero il Nobel nel 1930, nel quale di-mostrarono l’ effetto Raman. Partendo dall’osservazione dell’effetto Compton, nel quale i raggi X, in seguito allo scattering anelastico sugli elettroni perdono energia, ipotizzarono che si potesse verificare una simile perdita anche quando la luce è diffusa dalle molecole. Il nuovo tipo ti scattering necessitava radiazione luminosa con intensità molto elevate, motivo per cui questo tipo di spettroscopia si diffuse negli anni Settanta.

L’effetto Raman è il fenomeno di diffusione anelastica della radiazione elettroma-gnetica da parte del campione, a causa dell’interazione con i moti rotovibrazionali delle molecole ed è per questo motivo che ci fornisce informazioni sulla struttura molecolare e chimica di un campione. Approsimativamente lo scattering anaelastico è uno in dieci milioni rispetto a quello elastico (Rayleigh) e pertanto si ha bisogno di laser con una potenza elevata ed impulsi ultracorti ovvero dello stesso ordine di grandezza delle transizioni vibrazionali delle molecole.

1.1

Raman spontaneo

Facendo incidere una radiazione monocromatica a frequenza ω0 su un campione,

essa interagisce con i moti roto-vibrazionali delle molecole e si osserva che parte della luce incidente è diffusa alla stessa frequenza (scattering Rayleigh) mentre una percentuale minore subisce diffusione anelastica ed è diffusa a frequenza più bassa (scattering Stokes) o più alta (scattering anti-Stokes) di quella incidente. La diffusione anelastica avviene a ω0± Ω, dove Ω è una delle frequenze vibrazionali delle

moleco-le. Il fotone diffuso da parte di una molecola può guadagnare o perdere energia e pertanto è diffuso a energia più alta o più bassa di quella iniziale.

Quando il fascio a ω0incide sul campione, esso induce una fluttuazione dei contributi

elettronici alla polarizzabilità ed è da queste interazioni che si generano i fotoni a frequenza ωse ωasquindi affinchè una molecola sia Raman-attiva deve poter avere

un cambiamento nella polarizzabilità [4] (che si traduce in un cambiamento nella forma o nell’orientazione della nuvola elettronica). La frequenza incidente ω0 deve

essere diversa dalle frequenze in assorbimento del sistema, altrimeni l’effetto Raman è completamente schermato dall’assorbimento, e deve essere molto maggiore delle frequenze rotazionali e vibrazionali del sistema perchè se così non fosse, la luce

CAPITOLO 1. EFFETTO RAMAN 2 incidente non riuscirebbe a vedere la vibrazione e la rotazione, ma solo la loro media nel tempo.

Cerchiamo dunque di capire, in prima approssimazione e con argomentazioni clas-siche, cosa accade nel Raman spontaneo quando una radiazione monocromatica a frequenza ω0incide su una molecola e perchè si hanno i contributi Stokes e anti-Stokes.

Il momento di dipolo indotto dal campo elettrico è:

p(r, t) = α · E(r, t) (1.1)

dove α è il tensore di polarizzabilità e r è la coordinata macroscopica del sistema. Assumendo che le molecole non siano libere di ruotare, si può considerare il campione composto da un insieme di oscillatori armonici di coordinata vibrazionale Qk e,

considerando un solo moto vibrazionale di frequenza Ω, si può espandere il tensore polarizzabilità in serie di Taylor rispetto alle cordinate Qkintorno alla configurazione

di equilibro α0: α ≈ α0+ ∂α ∂Q     0 +1 2 ∂2_α ∂Q2     0 + ... = α0+ α00Q + 1 2α 00 0Q 2_{+ ..} (1.2) dove i valori calcolati in 0 sono calcolati nella posizione di equilibrio. In approssi-mazione armonica, l’equazione del moto per le coordinate Qkè

d2_Q dt2 + 2γ dQ dt + ω 2 0Q = 0. (1.3)

Trascurando il termine di smorzamento, ammette come soluzione

Q(t) = Q0cos (Ωt + δ) . (1.4)

Sostituendo la 1.4 nella 1.2 e fermandosi al primo ordine dello sviluppo in serie si ottiene:

α = α0+ α0kQ0cos (Ωt + δ) . (1.5)

Sia inoltre E(r, t) = E0cos (ω0t). Inserendo questa espressione e la 1.5 nella 1.1 e si

ottiene l’espressione per p

p = α0E0cos (ω0t) + α0E0Q0cos (ω0t) cos (Ωt + δ) (1.6)

che tramite le formule trigonometriche di Werner diventa:

p = p (ω0) +p (ω0− Ω) + p (ω0+ Ω) . (1.7)

É evidente che il dipolo elettrico indotto è formato da tre componenti distinte in frequenza ed in particolare non oscilla solo alla frequenza del campo incidente ω0 ma

anche, per effetto Raman, a ωs= ω0− Ω e ωas= ω0+ Ω.

Le righe anti-Stokes sono più deboli di quelle Stokes perchè, a causa del fattore di Boltzmann, gli stati eccitati sono meno popolati di quello fondamentale. Chiamando N1 le molecole nello stato 1 di energia E1, N2 le molecole nello stato 2 di energia

E2 > E1e sia T la temperatura, si ha:

N2

N1

CAPITOLO 1. EFFETTO RAMAN 3

Figura 1.1:Schema dei livelli energetici e delle corrispondenti linee in frequenza.

Dal punto di vista molecolare, lo scattering Raman spontaneo comporta il pas-saggio da uno stato i ad uno stato f attraverso lo stato v che può appartenere ad un pacchetto di stati stazionari (in tal caso si parla di Raman risonante) o essere virtuale. Il fotone incidente non è propriamente assorbito dalla molecola perchè ~ω0non

corri-sponde alla differenza energetica tra gli stati iniziale e finale. Dalla conservazione dell’energia segue che:

Ei = Ef → scattering Rayleigh

Ei < Ef → scattering Stokes

Ei > Ef → scattering anti-Stokes

Il Raman spontaneo non è un effetto lineare rispetto al campo che lo produce e per questo motivo il segnale è debole e molto meno intenso rispetto ai fenomeni lineari come l’assorbimento o la fluorescenza (difficile da distinguere dal Raman, se non per le componenti anti-Stokes), che nella pratica possono schermare completamente lo spettro. Inoltre nello studio di dinamiche ultraveloci è necessario utilizzare sorgenti impulsate di durata sufficientemente breve rispetto ai processi fisici e chimici e pertanto si ha un allargamento spettrale del segnale che compromette la risoluzione in frequenza. Dal principio di indeterminazione energia-tempo si ricava che per risolvere righe spettrali di ≈ 15cm−1 bisogna utilizzare impulsi di durata ∆t > 1ps.

1.2

Raman stimolato

Per superare le limitazioni del Raman sponteneo (bassa sezione d’urto, difficoltà negli esperimenti nelle scale di tempo tipiche dei processi ultraveloci, competizione con processi lineari) si introduce l’utilizzo di un ulteriore fascio. Con questa tecnica si riesce a collezionare rapidamente gli spettri vibrazionali ad alta risoluzione sulla scala dei tempi del f s [7], sia per lo stato elettronico fondamentale che per quelli eccitati. L’idea è quella di far incidere sul sistema impulsi luminosi di durata molto

CAPITOLO 1. EFFETTO RAMAN 4 minore dei tempi caratteristici di transizione: in questo modo si scompone il moto continuo in una serie di fotogrammi.

Il processo di scattering Raman stimolato (SRS) si verifica quando i due fasci di luce, la pompa Raman a frequenza ωp e lo Stokes probe a frequenza ωSvanno ad incidere su

un campione con frequenza vibrazionale ωvib = Ω = ωp− ωs. Si ottiene luce coerente

diffusa collinearmente al probe con sezione d’urto di diversi ordini di grandezza e proporzionale all’intensità dello Stokes.

Figura 1.2:Schema dei livelli energetici del Raman spontaneo (a) e stimolato (b). In quello stimolato si utilizza un solo campo d’interazione.

Bisogna quindi introdurre un termine forzante nell’equazione 1.3 che diventa: d2_Q dt2 + 2γ dQ dt + ω 2 0Q = α 0 k|E(r, t)| 2 (1.9) Il campo totale E(r, t) è dato dalla somma del campo del pump E(r, t)p = Epeiωpt

e dello Stokes probe E(r, t)s = Epeiωst. Si ottiene quindi:

|E(r, t)|2 = |Ep|2+ |Es|2+EpE∗se

i(ωp−ωs)t_+E∗

pEse−i(ωp−ωs)t. (1.10)

Gli utlimi due termini oscillano a Ω = ωp− ωsed esercitano quindi una forza di

ri-sonanza che mette in moto coerente la vibrazione delle molecole. I fotoni sono emessi collinearmente al probe e questo permette di selezionare la direzione di acquisizione e di migliorare il rapporto segnale rumore.

Una versione particolarmente utilizzata dell’ SRS, che permette di sondare un’ampia zona dello spettro con il probe è ottenuta con una pompa Raman a banda stretta, quindi lunga nel tempo, e un probe ultracorto, ovvero stretto in frequenza. Si otten-gono una serie di picchi sullo spettro dello Stokes probe in corrispondenza delle frequenze vibazionali del campione e si misura il Raman Gain (RG)

RG = ∆IS IS0

(1.11) in funzione di Ω dove IS0è l’intensità del probe e ∆IS è la differenza del segnale con

Capitolo 2

Spettroscopia Raman Coerente

Lo Scattering Raman Coerente (CRS) è un tipo di spettroscopia e microscopia che evita l’utilizzo di marcatori e che restituisce una firma chimica specifica della molecola, basata sulle sue vibrazioni molecolari caratteristiche. La spettroscopia coerente, basata sulla spettroscopia Raman, impiega più fotoni per selezionare le vibrazioni molecolari e produce un segnale coerente di ordini di grandezza più intenso dell’emissione Raman spontanea. La risoluzione spaziale in xy del Raman spontaneo e del Raman coerente è la stessa e corrisponde al limite di diffrazione1. Rispetto all’asse z invece, nel caso coerente la risoluzione aumenta grazie alla non linearità del fenomeno e nel caso spontaneo è aumentata grazie all’utilizzo dei microscopi confocali2.

Le tecniche di spettroscopia Raman coerenti sono divise in due step distinti. Nel primo step un set di laser ognuno a diversa frequenza, ma la cui combinazione lineare corrisponde alla frequenza vibrazionale del campione, incide su di esso e induce uno stato collettivo di vibrazione coerente. A differenza del Raman spontaneo in cui la fase con cui ogni molecola oscilla è casuale, nelle tecniche di CRS le molecole oscillano con la stessa fase e quindi in maniera coerente. Nel secondo step, un altro impulso, l’impulso di probe, interagisce con il campione e modula la coerenza vibrazionale generata alla stessa frequenza o a una frequenza diversa di quella degli impulsi del primo step. Nelle tecniche CRS con due laser coinvolti nel primo step, chiamati pump (ωp) e Stokes (ωs), la condizione per la quale le due frequenze devono essere in

risonanza con la frequenza vibrazionale del campione si traduce nella condizione ωp− ωs = Ω. Nel secondo step, il probe a ωpr, spesso degenere con uno dei precedenti,

fa si che l’intero processo è un four-wave mixing process perchè ωp− ωs+ ωpr = ωCRS.

1_{Un sistema ottico con la capacità di produrre immagini con risoluzione angolare al limite teorico}

dello strumento è definito diffraction limited ovvero è limitato dalla sola diffrazione. Ogni sistema ottico ha quindi un limite imposto da questo fenomeno e non può essere ulteriormente perfezionato [16]. Al contrario, il potere risolutivo di questi sistemi ottici può esser limitato da numerosi fattori tra cui l’imperfezione degli elementi ottici utilizzati o il loro male allineamento.

2_{Il microscopio confocale è un microscopio ottico che si basa su una tecnologia volta ad accrescere}

sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del campione [17].

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 6

2.1

Interazione non lineare luce-materia

L’effetto dell’interazione tra campo elettromagnetico e materia è la dislocazione di elettroni che, per campi deboli, è approssimabile come lineare, P (t) = 0χ(1)E(t)dove

χ(1) _{è la suscettività lineare. Per campi di intensità maggiore l’elettrone è dislocato}

dalla posizione di equilibrio e pertanto il potenziale di richiamo non può più essere considerato armonico e la polarizzazione è in generale espressa in serie di E(t) ([2])

P (t) = 0χ(1)E(t) + χ(2)E2(t) + χ(3)E3(t) + ...



(2.1) dove la quantità χ(n)_{corrisponde alla suscettività elettrica di ordine n. P è dunque la}

funzione di E che descrive la risposta del mezzo attraversato dall’onda elettromagne-tica caraterrizzata dal campo E. La suscettività lineare al primo ordine spiega tutte le proprietà ottiche standard dei materiali come rifrazione e riflessione, assorbimento ed emissione di un fotone. Quella del terzo ordine, di cui sfrutteremo le proprietà, è una caratteristica di ogni materiale e spiega fenomeni come la generazione di terza armonica, l’interazione a quattro onde, l’assorbimento a due fotoni ecc.

In ottica non lineare la polarizzazione varia nel tempo ed è quindi anch’essa sorgente di campo elettromagnetico. Applicando le equazioni di Maxwell possiamo scrivere:

∂2_{E(z, t)} ∂z2 − 1 c2 ∂2_{E(z, t)} ∂t2 = µ0 ∂2_{P (z, t)} ∂t2 (2.2)

dove la polarizzazione è composta da un contributo lineare e da uno non lineare P (z, t) = PL(z, t) + PN L(z, t). (2.3)

Esprimendo PN Lcome

PN L = pN Lei(ω0t−kpz), (2.4)

considerando un campo quasi monocromatico

E(z, t) = A(z)ei(ω0t−k0z) (2.5) e facendo alcuni conti sotto la condizione di lente variazioni del campo, si ottiene l’equazione che descrive la propagazione degli impulsi luminosi in mezzi non lineari e che tiene conto degli effetti di relazione di fase differenti tra la polarizzazione non lineare e il campo elettrico.

∂A(z, t) ∂z = − 1 vg ∂A(z, t) ∂z + i 2GV D ∂2A(z, t) ∂z2 − i µ0ω0c 2n pN L(z, t)e −i∆kz (2.6) Il primo termine del secondo membro descrive la propagazione nei materiali che avviene alla velocità di gruppo definita come

vg = 1 ∂k ∂ω
ω0 (2.7) ed il secondo descrive la dispersione tramite il group velocity mismatch definito come

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 7 GV D = ∂ 2_k ∂ω2  ω0 (2.8) Se GV D 6= 0 infatti, durante la propagazione nel materiale, l’impulso mostra un allargamento e quindi un calo nella potenza di picco. Infine il termine legato alla polarizzazione non lineare mostra che essa può modificare il campo elettrico.

L’effetto Raman è un processo del terzo ordine [13] quindi χ(3)_{6= 0 e}

P(3)(t) = 0χ(3)E3(t) (2.9)

A questo è direttamente legato il four-wave mixing process (FWM). Nel caso in cui i quattro fotoni coinvolti sono legati dalla legge di conservazione

ω4 = ω1− ω2+ ω3. (2.10)

e sostituendo l’espressione della polarizzazione non lineare dei quattro campi nell’equazione 2.6 si ottiengono le equazioni (accoppiate) del FWM:

         ∂A1(z,t) ∂z = −iα1χ (3)_A∗

2(z, t)A3(z, t)A4(z, t)e−i∆kz ∂A2(z,t)

∂z = −iα2χ (3)_A∗

1(z, t)A3(z, t)A4(z, t)e−i∆kz ∂A3(z,t)

∂z = −iα3χ (3)_A

1(z, t)A2(z, t)A∗4(z, t)e −i∆kz ∂A4(z,t)

∂z = −iα4χ (3)_A

1(z, t)A2(z, t)A∗3(z, t)e −i∆kz

(2.11)

Queste equazioni mostrano come l’evoluzione di ogni campo dipenda dall’ accoppiamento con gli altri tre in assenza di dispersione.

αi = 3 8 ωi cni . (2.12)

αiè la costante nonlineare di accoppiamento e il fattore numerico 3/8 deriva dal

fattore degenerativo. La condizione di phase mismatch

∆k = k1+ k2− k3− k4 (2.13)

legata alla perdita di segnale deve essere minimizzata ovvero ∆k → 0, che rappresenta, al limite, la conservazione del momento (phase matching).

Utilizzeremo la 2.11 per descrivere CARS, SRS e RIKES.

2.2

CARS

Lo scattering Raman coerente a frequenza anti-Stokes (Coherent Anti-Stokes Raman Sscattering) è un processo non lineare del terzo ordine realizzato tramite l’interazione a quattro onde nel quale sono necessari tre campi elettromagnetici a frequenza ω1, ω2

e ω3 per generare un segnale a frequenza ω4. Generalmente si usa un solo segnale a

frequenza ω1 = ω3 per eccitare il campione. Definiamo:

ω1 = ω3 = ωp

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 8 ω4 = ωas

dove ωp, ωse ωassono rispettivamente le frequenze di pump, Stokes e anti-Stokes.

A differenza del Raman spontaneo la spettroscopia CARS impiega più fotoni per selezionare le vibrazioni molecolari e produce un segnale coerente. Questo comporta che il segnale prodotto è diversi ordini di grandezza più intenso rispetto a quello dell’emissione spontanea.

L’interazione è coerente se è realizzata in condizioni di risonanza, ovvero se

ωp− ωs= Ω (2.15)

dove Ω è la frequenza vibrazionale propria delle molecole. Il segnale anti-Stokes generato da questa configurazione ha una frequenza pari a:

ωas= 2ωp− ωs. (2.16)

I fotoni di pump e Stokes popolano selettivamente gli stati eccetitati e i fotoni del secondo fascio di pump, chiamato probe, sono diffusi in maniera anelastica dallo stato vibrazionale generando così i fotoni alla frequenza di anti-Stokes, come è mostrato nel diagramma energetico.

Figura 2.1: a) Diagramma energetico; b) conservazione del momento (phase matching); c) output in frequenza.

Applichiamo il FWM process ai tre segnali:      ∂Ap(z,t) ∂z = −iαpχ (3)_A∗

p(z, t)As(z, t)Aas(z, t)e−i∆kz ∂As(z,t) ∂z = −iαsχ (3)_A2 p(z, t)A ∗ as(z, t)e −i∆kz ∂Aas(z,t) ∂z = −iαasχ (3)_A2 p(z, t)A ∗ s(z, t)e −i∆kz (2.17)

dove la condizione di phase mismatch è

∆k = kas− (2kp − ks) (2.18)

Considerando che il segnale CARS è generato alla frequenza anti-Stokes, utiliz-ziamo solo la terza delle equazioni della 2.17 per ricavare l’andamento dell’intensità del segnale di output. Integriamo quindi sulla lunghezza del campione L:

Z L 0 dAas(z, t) = −iαasχ(3)A2p(z, t)A ∗ s Z L 0 e−i∆kzdz. (2.19)

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 9 La soluzione del 2.17 è: Aas(L, t) = −iαasχ(3)A2p(z, t)A ∗ se −i∆kL/2 sinc(∆kL 2 ) (2.20) che corrisponde ad un’intensità pari a

Ias= |Aas(L, t)| 2 = α2_asχ(3) 2 IsIp2sinc 2₍∆kL 2 ) (2.21) É importante osservare che il segnale di CARS è proporzionale alla funzione sinc che è grande solo nel limite ∆k  π, limite per cui tende dalla δ di Dirac. In condizioni di perfetto phase matching la sinc tende ad 1, condizioni raggiunte se la focalizzazione dei segnali di pump e Stokes è perfetta, altrimensi il segnale di CARS è decrescente.

Un’ altra importante proprietà è nella dipendenza dalχ(3) 

2

perchè la suscettività può essere decomposta nel contributo risonante χR_{e in quello non risonante χ}N R_:

χ(3) = χ(3)R+ χ(3)N R. (2.22) Il contributo risonante, quello interessante da un punto di vista spettroscopico, è:

χ(3)R∼ N

ωp− ωs− Ω − iΓ

(2.23) dove Γ è la larghezza a mezza altezza della riga Raman. Questo contributo è massimo in condizioni di risonanza ovvero quando la differenza ωp − ωs coincide con la

frequenza vibrazionale del campione Ω. Dividendo il contributo risonante nella sua parte reale e immaginaria si ottiene che

ICARS ∝  χ(3)R+ χ(3)N R 2 =χ(3)R 2 +χ(3)N R 2 + 2χ(3)N Rχ(3)R_Re . (2.24) Il termine risonante contiene informazioni quantitative e chimiche riguardo al campione mentre il termine non risonante dipende dalle proprietà elettroniche del materiale e, lontano dalle risonanze elettroniche, è indipendente dalla frequenza e strettamente reale, ma non è invariante spazialmente in un campione eterogeneo. Questo può essere rimosso con delle tecniche di soppressione. L’ultimo termine mostra invece l’interferenza tra il contributo risonante e quello non risonante. Questo impedisce di conoscere direttamente il termine risonante, producendo forme di dispersione come possiamo vedere nella figura 2.2.

Ricapitolando:

• Dato che χ(3)R _{∝ N allora I}

CARS ∝ N2 dove N è il numero di molecole

Raman-attive pertanto è difficile rilevare concentrazioni poco abbondanti.

• La presenza del contributo non risonante fa si che vi è una parte di segnale, indipendente dalla frequenza, che può distorcere o coprire del tutto il segnale, tramite il termine puramente non risonante e tramite quello di interferenza. • L’aspetto favorevole è che il segnale CARS, privo di un background lineare, è

generato alla frequenza anti-Stokes e può pertanto essere selezionato dal campo di eccitazione tramite un filtro opportuno.

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 10

Figura 2.2:a) diagramma energetico del contributo non risonante; b) differenti contributi al segnale CARS.

2.2.1

Soppressione del contributo non risonante

La presenza del contributo non risonante impedisce al CARS applicazioni più ampie e sensibili quindi si sono sviluppati numerosi metodi per la soppressione del contributo non risonante.

• FM-CARS (Frequency Modulation CARS): il contributo risonante del CARS è le-gato alle vibrazioni molecolari e appare solo quando la condizione di risonanza dettata dalla 2.15 è soddisfatta, mentre il contributo non risonante è costante in un range di frequenze più ampio. Variando quindi lo Stokes a partire dalla frequenza di risonanza, il CARS diminuirà improvvisamente mentre il contri-buto non risonante resterà invariato. Con un amplificatore Lock-in si modula la frequenza di Stokes su due valori diversi ωS1 = ωSe ωS2in modo da avere

due output: per la prima si visualizzerà il segnale CARS e il NRB mentre per la seconda si visualizzerà solo il NRB.

Figura 2.3:Input e output del FM-CARS

• I-CARS (Interferometric CARS): utilizzando un altro segnale detto local oscillator a frequenza ωLO = ωCARS e ricordando che Eas ∝ Ep2Es∗χ(3) allora il segnale

CARS sarà proporzionale a

CARS ∝ (|Eas| + |ELO|)2 = |Eas|2+ |ELO|2+ + 2ELOEp2E ∗ sRe  χ(3)_{N R}+ χ(3)_R cos ϕ+ + 2ELOEp2E ∗ sIm  χ(3)_R  sin ϕ (2.25)

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 11 dove ϕ è la differenza di fase tra il CARS e il LO: scegliendo ϕ = 90o_{il contributo}

risonante immaginario è massimizzato mentre il contributo reale risonante e non-risonante è minimizzato; il primo termine può essere trascurato perchè |Eas|  |ELO| e il secondo termine è costante. In queste condizioni si sonda

Imχ(3)e si rivela quindi il NRB. Questo metodo è complicato perchè il setup sperimentale richiede la sincronizzazione di tre impulsi.

• Tr-CARS (Time resolved CARS): il ritardo temporale tra pump e Stokes, in con-dizioni di risonanza, crea una coerenza vibrazionale, che decade esponenzial-mente nel tempo in poche centinaia di femtosecondi, sondata dal probe dopo un tempo τ . Il contributo non-risonante decade istantaneamente, quindi questo metodo permette di rivelare il segnale risonante tramite un opportuno ritar-do τ , ma è generalmente accompagnato da una attenuazione significativa del contributo risonante.

Figura 2.4:a) Diagramma energetico del Tr-CARS; b) decadimento del CARS dovuto dal rilassamento vibrazionale.

• P-CARS (Polarization CARS): sfrutta le differenti proprietà di polarizzazione del contributo risonante e non-risonante. Assumendo il pump polarizzato lungo l’asse x e lo Stokes ruotato ruotato di un angolo φ rispetto ad esso ed in condizioni di risonanza, è indotta la polarizzazione del terzo ordine. La polarizzazione lineare e non lineare sono dirette in due direzioni diverse e quindi, ponendo un analizzatore nella direzione perpendicolare a quella di PN R

il contributo non risonante è eliminato. La proiezione totale della polarizzazione nella direzione dell’analizzatore è attenuata rispetto al segnale CARS e nella pratica è impossibile la perfetta soppressione del contributo non risonante a causa della presenza di effetti di birifrangenza legati agli elementi ottici. • E-CARS (Epi-Detection CARS): se la dimensione tipica delle molecole è piccola

o comparabile alla lunghezza d’onda anti-Stokes allora è possibile la diffusione del segnale CARS anche indietro. Questo può avvenire anche da riflessioni per discontinuità di χ(3) _{nel campione. La rivelazione in direzione opposta a}

quelle incidenti, può essere quindi utilizzata per isolare il segnale CARS di molecole piccole dal segnale generato dal substrato di molecole ingombranti. Questo metodo filtra il segnale in base alle dimensioni delle particelle e quindi il segnale che deriva dalle particelle ancora più piccole può distorcere l’epi-CARS: per questo motivo è un metodo con sensibilità limitata ([11]).

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 12

Figura 2.5:Schema dei vettori di polarizzazione nel P-CARS

2.3

SRS

Lo scattering Raman stimolato, Stimulated Raman Scattering come abbiamo visto nel capitolo 2, coinvolge due impulsi, la pompa Raman e lo Stokes, e quando la loro differenza in frequenza è uguale alla frequenza vibrazionale allora la molecola è eccitata dallo stato fondamentale allo stato vibrazionale eccitato, passando per lo stato virtuale. Si ha quindi la creazione dell’impulso di Stokes che si misura con l’ SRG, stimulated Raman Gain, e l’annichilazione dell’impulso di pump che si misura con l’ SRL, stimulated Raman Loss. Il segnale è alla stessa frequenza dei campi in ingresso e bisogna quindi misurare il cambiamento nell’intensità con e senza interazione con la materia.

Figura 2.6: a) schema energetico; b) cambiamento nell’intensità di pump e stokes dopo l’interazione non lineare con la materia

L’ SRS può essere spiegato come un processo del terzo ordine, come il FWM, ma tra due onde:

(_∂Ap(z,t) ∂z = −iαpχ (3)_A∗ s(z, t)As(z, t)Ap(z, t) ∂As(z,t) ∂z = −iαsχ (3)_A∗ p(z, t)Ap(z, t)As(z, t) (2.26) Notiamo che la condizione di phase matching è automaticamente soddisfatta:

∆k = ks+ kp− ks− kp = 0. (2.27)

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 13 Z L 0 dAs(z, t) = −iαsχ(3)A2p Z L 0 As(z, t) dz (2.28) As(L, t) = As(0, t)Le−iαsχ (3)_|Ap|2 ∼ As(0, t) 1 − iαsχ(3)|Ap|2L
(2.29) ∆As = As(L, t) − As(0, t) = −iαsχ(3)|Ap| 2 L (2.30)

I detector sono sensibili alle medie temporali delle intensità quindi assumendo |∆As| 2 u 0 e si ottiene: Is(L, t) = |As(0, t) + ∆As|2 = = |As(0, t)|2+ 2< (A∗s(0, t)∆As) = = Is(0, t) + 2Re (A∗s(0, t)∆As) =

= Is(0, t) + 2Re −A∗s(0, t)iαsχ(3)|Ap|2As(0, t)L

(2.31)

L’ultimo termine mostra che il segnale è amplificato dal campo di Stokes stesso. Si può espandere χ(3)_{nel contributo risonante, separato in parte reale e immaginaria,}

più quello non risonante, reale puro ed ottenere:

Is(L, t) = Is(0, t) + 2αsImχ(3)RIpIs(0, t)L (2.32)

Facendo gli stessi conti per Ipsi possono ricavare le espressioni per le variazioni

dell’intensità dei due segnali

SRG = ∆Is Is(0, t) = 2αsImχ(3)RIpIs(0, t)L (2.33) SRL = ∆Ip Ip(0, t) = −2αpImχ(3)RIsL (2.34)

Entrambe le misure sono proporzionali a χ(3)R_{e questo fa si che il segnale non è}

influenzato dal contributo dovuto a χ(3)N R_{ed è pertanto privo del background non}

risonante e di effetti di distorsione, presenti invece nel CARS. Un altro vantaggio è la proporzionalità diretta rispetto alla concentrazione delle molecole N , motivo per cui questa tecnica è più comoda alle basse concentrazioni. Il problema è che il segnale SRS sta sul background dello Stokes ed è sensibile alle instabilità di esso e difficile da rilevare: si ha bisogno contemporaneamente di un modulatore e di un amplificatore lock-in (vedi capitolo 3).

2.4

RIKE(S)

Il RIKE(S), Raman induced Kerr Effect (Spectroscopy) è una tecnica simile all’ SRS, con ω1 = ω3 = ωpe ω2 = ω4 = ωs, ma la polarizzazione di pump e Stokes è differente.

In condizioni di risonanza con la frequenza vibrazionale del campione, si inducono effetti Raman di birifrangenza che modificano il campo di Stokes. Bloccando con un polarizzatore il campo di Stokes in ingresso e trasmettendo quello ortogonale generato dal RIKE si rivela il segnale. Generalmente si usano due configurazioni:

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 14 • RIKE lineare: il pump è polarizzato a 45° rispetto allo Stokes;

• RIKE circolare: il pump è polarizzato circolarmente.

Figura 2.7:Schema del RIKE: polarizzazioni di pump e Stokes prima e dopo l’interazione con la materia.

Utilizzando le equazioni del FWM come per l’ SRS si ottiene l’espressione per il segnale RIKE:

∆As ∝ −iχ(3)|Ap|2AsL. (2.35)

In questo caso bisogna tener conto della polarizzazione dei segnali e della scuscettivi-tà del terzo ordine, come un tensore di rango quattro, χ(3)ijkldove i, j, k, l sono gli indici

dei quattro campi coinvolti: Ei(ω1), Ej(ω2), Ek(ω3), El(ω4)in x, y, z. In generale χ(3) è

composto da 81 elementi ma sfruttando le regole di simmetria nel caso di campioni isotropi si ottiene che il segnale di

• RIKE lineare è

∆Alin_s ∝ iχ(3) _{= i}h_χ(3) 1122+ χ (3) 1212 i |Ap|2AsL (2.36) • RIKE circolare è

∆Acirc_s ∝ iχ(3) _{= −}h_χ(3) 1122− χ (3) 1212 i |Ap| 2 AsL (2.37)

Espandendo χ(3)_{nei suoi contributi risonante/non risonante e reale/immaginario}

si ottiene che nel caso di RIKE circolare il segnale è proporzionale a soli contributi risonanti ed è quindi privo del NRB, che nel caso lineare è presente ed è per questo motivo che a livello pratico è più ragionevole l’utilizzo della configurazione circolare.

• RIKE lineare

∆Alin_s ∝ ihχ(3)R_1122,Re+ χ(3)R_1122,Im+ χ(3)N R_1122,Re+ χ(3)R_1212,Re+ χ(3)R_1212,Im+ χ(3)N R_1212,Rei (2.38) • RIKE circolare

∆Acirc_s ∝ −hχ(3)R_1122,Re+ χ(3)R_1122,Im+ χ(3)N R_1122,Re− χ(3)R_1212,Re− χ(3)R_1212,Im− χ(3)N R_1212,Rei (2.39) Per le simmetrie di Kleinman χ(3)N R1122,Re = χ

(3)N R

1212,Re quindi si ottiene:

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 15 Introducendo la suscettività χ(3)ef f che contiene al suo interno i termini mostrati

nelle equazioni sovrastanti per ogni caso, si può scrivere: IRIKE ∝   χ (3) ef f    2 |Ep| 2 EsL (2.41)

2.4.1

BD-RIKE

Nonostante il crescente utilizzo delle tecniche di CRS, esse devono affrontare gravi inconvenienti, che impediscono il loro utilizzo per applicazioni più ampie. Nel tentativo di superare questi limiti, è stata sviluppata [15] una nuova tecnica di spettroscopia CRS: Balanced Detection Raman Induced Kerr Effect (BD - RIKE), che combina i vantaggi della spettroscopia Raman Coerente anti-Stokes (CARS), come il fatto di essere linear-background-free, e i vantaggi dello Scattering Raman Stimolato (SRS), quali l’assenza di background non risonante e la dipendenza lineare dalla concentrazione [2]. Inoltre, grazie alla possibilità di misurare sia la parte immaginaria che quella reale della suscettività non lineare, la tecnica BD-RIKE dà accesso diretto alla fase vibrazionale e, con la rivelazione bilanciata si elimina efficacemente il rumore del laser. L’apparato sperimentale è mostrato in figura 2.8.

Figura 2.8:Setup sperimentale per il BD-RIKE.

Per il RIKE lineare la lamina utilizzata è una λ/2 mentre per il caso circolare si utilizza una λ/4. 3Dopo che i due impulsi vengono combinati tramite un beam splitter dicroico, sono focalizzati sugli obiettivi e sul campione. Il pump è bloccato dai filtri mentre lo Stokes viene rivelato, passando prima per una lamina dello stesso tipo di quella utilizzata precedentemente che rende la polarizzazione dello Stokes nel primo caso ruotata di 45o _{e nel secondo circolare. Un prisma Wollaston separa}

il fascio in due componenti di polarizzazione ortogonale che vengono rivelate da un diodo bilanciato. Questo fa si che: se non si sta in condizioni di risonanza o se il

3_{Per il RIKE lineare la polarizzazione del pump deve essere ruotata di 45}o_{rispetto allo Stokes.}

Si utilizza una lamina λ/2 inclinata di un angolo θ = 22.5o _{cosicchè la polarizzazione in uscita è}

ruotata di 2θ = 45o_{rispetto a quella incidente e quindi allo Stokes. Per ottenere la polarizzazione}

circolare si utilizza una lamina λ/4 che forma un angolo di 45o_{con l’asse verticale corrispondente alla}

CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE 16 pump è bloccato dal modulatore, le due componenti rivelate sono tra loro uguali e quindi il segnale è nullo mentre, quando il segnale RIKE è generato, lo Stokes cambia leggermente la sua polarizzazione e il diodo rileva due intensità diverse da quelle in assenza di pump. Così si misura la variazione del segnale di Stokes, ovvero il Raman Gain.

Questa tecnica offre numerosi vantaggi tra i metodi del CRS. Il segnale ottenuto è libero da tutti i tipi di background perchè, grazie alla balanced detection, è rimosso il rumore del laser, è proporzionale alla concentrazione N e la conoscenza di parte Reale ed Immaginaria della suscettività del terzo ordine da informazioni aggiuntive sulla fase vibrazionale. I risultati che si ottengono sono in perfetto accordo con quelli teorici e gli esperimenti di microscopia mostrano il grande potenziale di questa tecnica per l’imaging biologico e le sue applicazioni [11].

Capitolo 3

Apparato sperimentale e risultati

ottenuti

3.1

Apparato sperimentale

L’esperimento è stato svolto presso i laboratori dell’ IIT, Istituto Italiano di Tecnolo-gia. In figura è mostrato schematicamente l’assetto del banco ottico che ha lo scopo di poter studiare spettri CARS e BD-RIKE lineare.

La sorgente è un laser Plecter della Coherent che lavora ad un rate di 80M Hz di lunghezza d’onda λ = 1064nm, potenza di 10W e impulsi di durata di 8ps ed è utilizzato come segnale (fisso) di Stokes mentre la sua seconda armonica, a λ = 532nm, potenza di 5W e impulsi di 7ps, entra nell’OPO, la cui uscita signal è il segnale tunabile utilizzato come pump. Entrambi i segnali sono polarizzati verticalmente. La seconda armonica dello Stokes compie dentro l’OPO ∆L ∼ 2, 4m che lo Stokes deve recuperare prima che i due segnali si ricongiungano per poterli sovrapporre spazialmente e temporalmente.

Studiamo il percorso dei due segnali separatamente prima e dopo il beam splitter (BS) dicroico su cui si sovrappongono.

Studiamo quindi Sokes e OPO separatamente prima della loro sovrapposizione. Il segnale di Stokes è innanzitutto attenuato e polarizzato, compie una serie di riflessioni per percorrere lo stesso cammino ottico dell’OPO, passa poi per la delay line, per un collimatore che collima e focalizza il segnale con l’utilizzo di due lenti (con rapporto tra le focali di ∼ 1.33) e dopo essere polarizzato è trasmesso dal beam splitter (BS). Il segnale dell’ OPO passa come prima cosa per un filtro che leva le componenti visibili, ed in seguito, per attenuarlo e polarizzarlo verticalmente si utilizzano due glan polaroid verticali e un polaroid ruotato di un angolo θ: il primo glan polarizza verticalmente il segnale in uscita dall’OPO (ripulendolo dalle componenti non polarizzate verticalmente), il secondo polaroid inclinato di un angolo variabile fa passare Esinθ se E è il campo uscente dal primo glan ed infine il terzo glan polarizza verticalmente il segnale. Con questo metodo si attenua e polarizza un segnale senza l’utilizzo di filtri, molto delicato a causa della forte potenza del segnale. Il segnale è poi fatto passare per una lente, un modulatore e un’altra lente: le due lenti servono a non renderlo ne convergente e ne dievergente (variandone la distanza focale) e il modulatore, collegato ad un generatore di segnali di ondra quadra che generalmente oscilla ad alta frequenza, modula il segnale in modo da poter

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 18

Figura 3.1: Apparato sperimentale. La linea tratteggiata è la modulazione del segnale dell’OPO. [S=specchio, L=lente, P=polarizzatore, GP= polarizzatore Glan, CR=cristallo (NL)].

misurare, nel caso del BD-RIKE le differenze di intensità dello Stokes in presenza o no dell’OPO. La modulazione avviene attraverso un amplificatore Lock-in collegato ad un generatore di segnali di onda quadra. Sfruttando la diffrazione del modulatore e con l’utilizzo di uno specchio tagliato, si riflette il primo ordine di diffrazione, che una volta pulito e attenuato, viene rivelato: misurandone intensità e lunghezza d’onda si ricavano le caratteristiche dell’OPO. La componente trasmessa è polarizzata, riflessa e fatta passare per una lamina λ/2 (valida per un ampio range di lunghezze d’onda, necessaria per il RIKE) e poi riflessa dal BS. Nel grafico possiamo osservare i due percorsi appena descritti.

Il segnale, una volta sovrapposto, è quindi fatto passare per un primo obiettivo, per il campione e per il secondo obiettivo e viene poi rivelato. La rivelazione del CARS è immediata: ricordando che il segnale di CARS ha frequenza diversa da quella di Stokes e pump, ed in particolare frequenza maggiore e quindi lunghezza d’onda minore delle due in ingresso, basta bloccare i due segnali con opportuni filtri passa basso in termini di lunghezza d’onda. In questo caso si fa riflettere Nel caso del RIKE il segnale viene fatto precedere, passa per una lamina λ/2 e per un cristallo non

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 19 lineare (Glan Thompson) che separa il fascio in due fasci divergenti di ∼ 10o_{. Questi}

vengono riflessi da una coppia di specchi a 45o_{che mandano i due fasci nel detector.}

Ciascun fascio, di uguale intensità, è fatto passare per una lente (le due lenti hanno focale diversa perchè messe a distanza diversa dal detector) e poi rivelato (acquizione a 45o_{). Il setup sperimentale di questa parte è mostrato in figura 3.2.}

Figura 3.2:I due fasci dopo il BS. Per rivelare il CARS il fascio è riflesso e segue il percorso arancione, mentre per il BD-RIKE lo specchio è rimosso e la luce segue il percorso rosso. [L=lente; S=specchio; F=filtro; CR= cristallo (non lineare)].

Per effettuare gli esperimenti nelle condizioni più stabili la temperatura del laboratorio è mantenuta a T ∼ 24o_{, la luce è spenta e il banco ottico viene chiuso.}

3.1.1

Operazioni preliminari

Come prima cosa è importante l’allineamento dei fasci. Questo è realizzato al-lineando gli specchi a coppie: ogni specchio è affiancato da un iris e si allinea il primo specchio con l’iris del secondo e viceversa. Il fascio inoltre non deve essere ne convergente ne divergente: si utilizzano due iris ai due estremi del banco ottico e si controlla la sezione del fascio con le carte IR.

Per la sovrapposizione temporale di Stokes e pump si è utilizzato un oscilloscopio in modalità di trigger esterno collegato al laser per avere un tempo di riferimento indipendente dei due impulsi e poter così rendere minimo il ritardo temporale (assoluto) tra essi. Per la sovrapposizione spaziale si fa in modo che pump e Stokes compiano lo stesso cammino ottico: in prima approssimazione si misura il cammino dei due impulsi con il metro ricordando il percorso dentro l’OPO e poi, grazie alla delay line si massimizza il picco dello spettro osservato che è massimo quando i due percorsi compiono esattamente lo stesso cammino ottico. Una volta massimizzato il picco non si sposta più la posizione della delay line.

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 20

3.1.2

OPO

L’ optical parametric oscillator è un oscillatore parametrico, ovvero un oscillatore i cui parametri oscillano nel tempo, che oscilla alle frequenze ottiche. Converte un segnale laser in ingresso a frequenza ωpin due uscite a frequenza minore: il signal a

ωs e l’ idler a ωi ≤ ωs (per motivi storici) ed il pump residuo. Trascurando il pump

Figura 3.3:Struttura dell’OPO.

residuo, vale la relazione

ωp = ωs+ ωi (3.1)

L’OPO è una sorgente luminosa simile ad un laser perchè utilizza anch’esso una cavità risonante, ma si basa sull’amplificazione parametrica in un cristallo non lineare e non sull’emissione stimolata. La limitazione principale è che ha una soglia sulla potenza del pump al di sotto della quale l’uscita è trascurabile: in ingresso deve avere una sorgente caratterizzata da un’alta intensità ottica e una buona coerenza spaziale, motivo per cui si utilizza un laser come pump. La principale caratteristica dell’OPO per cui è molto utilzzato in spettroscopia è che signal e idler, determinati da una condizione di phase matching, possono esser fatti variare in un ampio range di lunghezze d’onda, variando la lunghezza della cavità L e la temperatura di essa, e quindi l’OPO si comporta come una sorgente luminosa di lunghezza d’onda variabile. Nell’esperimento si è utilizzato un OPO della AP E, il Levante Emerald che, con luce verde in ingresso (la seconda armonica del laser è nel verde), è una sorgente di impulsi al pico secondo ad alta potenza ampiamente tunabile. Gli impulsi sono tunabili tra 690nm e 990nm per il signal e tra 1150nm e 2300nm per l’idler e questi sono generati e quindi disponibili contemporaneamente.

3.2

Risultati ottenuti

I due spettri sono stati presi su un campione di acetone, C3H6O, la cui struttura

è mostrata in seguito, solvente utilizzato per testare l’apparato sperimentale e per poterlo poi utilizzare su altri materiali, come nel nostro caso sul grafene; il suo spettro Raman è mostrato in figura 3.5 ed ha un picco singolo e forte a 2918cm−1 che corrispone al livello energetico del legame CH3.

3.2.1

CARS

I dati CARS sono stati presi con uno spettrometro che da come output la lun-ghezza d’onda λ e l’intensità (associata ai conteggi). Lo spettro della radiazione

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 21

Figura 3.4:Struttura dell’acetone.

Figura 3.5:Spettro Raman dell’acetone.

anti-Stokes riportato in figura 3.6 mostra un picco a λas= 656.5nme rappresenta la

componente dello spettro CARS a frequenza 15232cm−1. L’intero spettro vibraziona-le e’ ottenibivibraziona-le variando la lunghezza d’onda dell’OPO e corrispondentemente λas

secondo l’equazione 2.16.

Sono stati acquisiti due spettri. Nel primo spettro, mostrato in figura 3.6 si osser-vano due massimi: uno a λ = 532nm che corrisponde alla seconda armonica dello Stokes e pertanto lo trascureremo nel confronto tra lo spettro ottenuto e lo spettro Raman, mentre il picco a λ = 656.5nm, presente in entrambi gli spettri, è il segnale CARS. Studieremo quindi solo uno dei due spettri presi.

Per ottenere il Raman shift ovvero la frequenza vibrazionale Ω si sfruttano le relazioni 2.15 e 2.16. Lo spettro ottenuto è mostrato in figura 3.8.

Si può quindi confrontare il picco rivelato con lo spettro Raman dell’acetone: si vede che questi sono completamente sovrapposti e pertanto lo spettro ottenuto è consistente con quello teorico [14] .

3.2.2

BD-RIKE

Con un programma si legge l’output dell’OPO e l’output del diodo bilanciato e si ha un file con varie informazioni tra cui: la lunghezza d’onda dell’OPO, l’intensità dell’OPO, l’intensità rivelata dal diodo bilanciato e l’intensità rivelata dal diodo normalizzata all’intensità dell’OPO. Da λOP O si ricava il Raman shift Ω espresso in

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 22

Figura 3.6:Spettro CARS in funzione di λ: il picco a λ = 532nm è la seconda armonica dello Stokes mentre il picco a λ = 656.5nm è il segnale CARS.

cm−1. Sono state fatte due acquisizioni nello stesso intervallo di lunghezze d’onda che riportiamo nelle seguenti figure.

Procediamo dunque confrontando lo spettro ottenuto con il Raman dell’aceto-ne considerando l’intensità rivelata dal diodo bilanciato: si vede che questi sono completamente sovrapposti e pertanto lo spettro ottenuto è consistente con quello teorico.

3.2.3

Confronto e conclusioni

Si possono confrontare i due spettri acquisiti, CARS1 e RIKE, e osservare che sono quasi completamente sovrapposti. Il RIKE ha sempre le code più larghe del CARS come si può osservare nella figura. I picchi distano 7cm−1 che è un errore assolutamente trascurabile ma, di cui discuteremo eventuali cause in seguito.

Possiamo inoltre osservare che in entrambi i casi il nostro apparato sperimentale non rivela i picchi secondari che stanno alla base del picco del Raman [14]. Questi sono picchi di larghezza molto minore di quello principale e quindi, non vengono rivelati perchè il potere risolutivo non è sufficiente a risolvere queste righe. I motivi per cui questo avviene oppure per cui si ha un allargamento spettrale sperimentale od una eventuale fonte di errore sono legati a due cause: il campione e l’apparato. Per quanto riguarda il campione le cause dell’allargamento spettrale sono: l’allargamento naturale dovuto al principio di indeterminazione tempo-energia che collega il tempo di vita di uno stato eccitato con la precisione della sua energia; l’effetto Doppler

1_{Ricordiamo che lo spettro CARS non è un vero e proprio spettro vibrazionale quindi questo}

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 23

Figura 3.7:Confronto tra lo spettro Raman e il CARS.

poichè, se gli atomi si muovono con velocità diverse allora vengono assorbiti fotoni di energia diversa e vi sarà uno spostamento in frequenza nello scattering della luce. Per quanto riguarda l’apparato sperimentale, innanzitutto bisogna tener conto del fatto che il laser non ha una riga di emissione pari ad una δ di Dirac, ma è una gaussiana centrata intorno alla propria lunghezza d’onda nominale (1064nm): l’intensità dello Stokes dipende quindi dalla lunghezza d’onda emessa in ogni istante. Nella pratica si osserva pertanto la convoluzione tra i picchi che si dovrebbero osservare teoricamente e la gaussiana caratteristica del laser. Inoltre l’esperimenso non è svolto in regime continuo, ma discreto e i vari filtri che bloccano pump e Stokes e che ripuliscono il segnale CARS da altre lunghezze d’onda, non lo rendono esattamente monocromatico, ma fanno passare anche altre componenti. Ricordiamo inoltre che nel CARS è presente il contributo non risonante che può disturbare il segnale e spostare leggermente la posizione del picco.

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 24

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 25

Figura 3.9:Spettro RIKE, 1: il picco è in corrispondenza di Ω = 2909cm−1.Nelle ordinate: nella prima figura è riportata l’intensità rivelata dal diodo bilanciato mentre nella seconda quella normalizzata all’intensità dell’OPO.

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 26

Figura 3.10:Spettro RIKE, 2: il picco è in corrispondenza di Ω = 2911cm−1.Nelle ordinate: nella prima figura è riportata l’intensità rivelata dal diodo bilanciato mentre nella seconda quella normalizzata all’intensità dell’OPO.

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI 27

Figura 3.11:Confronto tra lo spettro Raman e il RIKE.

Capitolo 4

Conclusioni

La ricerca di metodi per poter studiare le proprietà molecolari della materia ad alta risoluzione mostra sempre più interesse ed applicazioni. La microscopia vibrazionale coerente, che unisce un microscopio alle tecniche di Scattering Raman Coerente, fornisce un metodo capace di studiare le proprietà chimiche della materia facendo imaging non invasivo e label-free. La crescita di questo ambito di ricerca è notevolmente aumentata negli ultimi anni, grazie alle nuove tecnologie dei laser e a nuovi metodi sperimentali.

Questa dissertazione pone le basi della teoria dello scattering Raman coerente: partendo da un’introduzione sull’effetto Raman, spontaneo e stimolato, trattato con argomentazioni classiche. Il CRS supera la principale limitazione del Raman, troppo debole da rilevare, grazie alla coerenza vibrazionale indotta nel moto di oscillazione delle molecole. Introducendo campi di intensità elevata bisogna studiare l’interazione non lineare tra luce e materia: sono i fenomeni del terzo ordine, tra cui in particolare il FWM process che spiegano il CRS. In particolare, è stato discusso il CARS. Il segnale è facilmente rilevato perchè generato a frequenza di quelle incidenti, ma è proporzionale al quadrato della concentrazione N ed ha il grande problema di avere il background non risonante. Per questo motivo sono state sviluppate e discusse numerose tecniche di sopressione del NRB. Lo SRS ha i principali vantaggi, confrontato al CARS, di essere privo del NRB e di essere proporzionale a N , motivo per cui è più utile per le basse concentrazioni. Il segnale sta sul background dello Stokes, motivo per cui è sensibile ad eventuali instabilità di esso e, soprattutto, è più difficile da rilevare (si utilizza un modulatore ed un amplificatore Lock-in). Il RIKE, privo del NRB solo nel caso lineare, è una valida alternativa alle altre tecniche nella sua versione BD che permette una più facile rivelazione del segnale rispetto a SRS e RIKE, ma soprattutto una migliore sensibilità, minor rumore e informazioni aggiuntive.

É stato inoltre descritto il setup sperimentale realizzato ai laboratori dell’ IIT e utilizzato per poter eseguire tutte queste tecniche. Nella pratica sono stati eseguiti, su un campione di acetone, uno spettro CARS spettro BD-RIKE. Si è visto che gli spettri ottenuti sono in accordo con il Raman teorico e tra di loro.

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